Eine einfache und kostengünstige Test zur Messung der Gehfähigkeit in Mausmodellen der Muskeldystrophie
29. Dezember 2017
Dieses Protokoll beschreibt ein flexible und kostengünstige System zur Messung Maus Gehfähigkeit in ein offenes Feld Aktivität Assay. Wir zeigen, dass ein 6-minütige Gehfähigkeit Assay basiert auf diesem System eine Abnahme der Freiwillige Bewegung in Mdx Mäuse erkennt und Verbesserung der Muskel-spezifische Rettung dieser Tiere genau unterscheidet.
Das übergeordnete Ziel dieses Assays besteht darin, die freiwillige Fortbewegung bei Mausmodellen der Muskeldystrophie zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Muskeldystrophie zu beantworten, beispielsweise zum Fortschreiten der Muskelschwäche bei Mausmodellen der Muskeldystrophie sowie zur Wirksamkeit potenzieller Therapeutika. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine nichtinvasive und reproduzierbare Messung der Tieraktivität ermöglicht, die leicht an zahlreiche verschiedene Forschungsumgebungen angepasst werden kann.
In einem ruhigen, temperaturgeregelten Raum zur gleichen Tageszeit eine Kamera auf einem Drahtgitter über der Aktivitätskammer platzieren, um die Aufnahme über die gesamte Versuchsarena zu ermöglichen, und die Kammer mit Desinfektionsmittel reinigen. Unmittelbar vor der Aktivitätsaufnahme die Maus am Stab eines digitalen Kraftmessgeräts greifen lassen und vorsichtig nach hinten ziehen, bis der Stab losgelassen wird. Den maximalen Kraftwert in Newton für jeden Durchgang aufzeichnen.
Mit einer Minute Pause zwischen den Durchgängen. Unmittelbar nach dem Griffkrafttest das Maus in die Kammer setzen und die Videoaufnahme starten, wobei die Maus sich frei bewegen kann. Nach sechs Minuten die Aufnahme beenden und die Maus in ihren Heimkäfig zurückbringen.
Öffnen Sie zur Verfolgungsanalyse der Videodaten zunächst die Aufnahme in der geeigneten Videobearbeitungssoftware und stellen Sie die Geschwindigkeit auf das Zweifache ein. Exportieren Sie das heruntergerechnete Video im mp4-Dateiformat zur Verfolgungsanalyse und öffnen Sie das Video in dem entsprechenden Videoanalyseprogramm. Um die Kalibrierung der Videoaufnahme einzurichten, verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie entlang einer Seite der Kammer zu zeichnen.
Rechtsklicken Sie auf die Linie, wählen Sie „Kalibrierung messen“ aus und geben Sie die tatsächliche Größe der Kammerseite in Zentimetern ein. Um die halbautomatische Verfolgung der Mausposition zu starten, klicken Sie auf den Bewegungszeiger. Beginnend mit dem ersten Bild im Video, rechtsklicken Sie auf den Punkt, der verfolgt werden soll.
Der Verfolgungspunkt wird mit einem blauen Kreis markiert. Verwenden Sie den rechten Pfeil auf der Tastatur, um zum nächsten Frame zu wechseln. Der Verfolgungspunkt sollte sich automatisch basierend auf der Position der Schwanzwurzel bewegen.
Wenn die Tracking-Position in einem bestimmten Bild nicht mit dem Punkt von Interesse übereinstimmt, manuell den blauen Kreis mit der Tracking-Position ausrichten. Wenn das gesamte Video getrackt wurde, speichern Sie das Video und die Überlagerung der Spur und wählen Sie „Export in Tabelle“, um die Positionsdaten der Spur zu exportieren. In Übereinstimmung mit Ergebnissen, die aus ähnlichen Assays berichtet wurden, zeigen dystrophindefiziente mdx-Mäuse, die unmittelbar vor der Untersuchung einem Belastungsprotokoll ausgesetzt wurden, in einem Sechs-Minuten-Offenes-Feld-Test signifikant weniger freiwillige Bewegung als Wildtyp-Tiere.
Tatsächlich verharrten die mdx-Mäuse nach der leichten Belastung eines Griffkrafttests gewöhnlich in den ersten Minuten des Gehprotokolls regungslos, wobei eine geringfügige Zunahme der Bewegung zwischen der vierten und fünften Minute beobachtet wurde. Beim Vergleich von Wildtyp- und mdx-Tieren ohne vorherige Belastung zeigten sich hingegen keine Unterschiede in der zurückgelegten Distanz. Mdx-Mäuse, die transgen für die Expression von Utrophin sind, unterschieden sich nicht von Wildtyp-Tieren, wobei keine signifikanten Unterschiede in der insgesamt zurückgelegten Distanz oder zu irgendeinem der kumulativen Beobachtungszeitpunkte festgestellt wurden.
Um den Effekt einer verringerten Abtastrate zu bestimmen, wurde die gesamte zurückgelegte Distanz aus einer Minute Vollbildraten-Video gemessen und mit den Distanzmessungen verglichen, die aus heruntergerechneten Versionen des Datensatzes abgeleitet wurden. Eine Halbierung der Bildrate verringerte die gemessene Distanz um 5 % der ursprünglich berechneten Distanz. Die Genauigkeit der gemessenen Distanz nimmt danach stark ab, obwohl auch stark dezimierte Datensätze den Pfad des Tieres noch eng annähern. Dies unterstreicht die Bedeutung der Berücksichtigung von Bildrate und Signalverarbeitung bei der Beurteilung tierischer Aktivität und zeigt, dass eine hohe räumliche Auflösung in heruntergerechneten Videodaten erhalten bleiben kann.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Fortbewegung von Mäusen in einer offenen Umgebung aufgezeichnet und analysiert werden kann. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann die Analyse bei korrekter Durchführung in 15 bis 30 Minuten abgeschlossen werden. Dieser kostengünstige und nicht-invasive Test ermöglicht es Forschern, die motorische Aktivität bei Mausmodellen der Muskeldystrophie zu untersuchen, und kann als aussagekräftiger erster Schritt für weitere funktionelle Messungen dienen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt ein flexibles, kostengünstiges System zur Messung der Fortbewegung von Mäusen in einem Open-Field-Aktivitätsassay. Die Methode ermöglicht eine nichtinvasive und reproduzierbare Erfassung der Tieraktivität, die an verschiedene Forschungsumgebungen angepasst werden kann.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Forschung zur Muskeldystrophie
- Verhaltensanalyse
Hintergrund
- Der Test misst die freiwillige Fortbewegung bei Mausmodellen der Muskeldystrophie.
- Er befasst sich mit zentralen Fragen zum Fortschreiten der Muskelschwäche.
- Die Methode dient dazu, die Wirksamkeit potenzieller Therapeutika zu bewerten.
- Die Aufzeichnung erfolgt in einer kontrollierten Umgebung, um Konsistenz zu gewährleisten.
Zweck der Studie
- Um die freiwillige Bewegung bei mdx-Mäusen zu messen.
- Um die Wirkung muskelspezifischer Interventionen zu bewerten.
- Um Erkenntnisse über den Verlauf der Muskeldystrophie zu gewinnen.
Verwendete Methoden
- Verwendung einer über der Aktivitätskammer positionierten Kamera zur Aufzeichnung.
- Reinigung der Kammer mit Desinfektionsmittel vor den Versuchen.
- Ermöglichen, dass die Maus einen Stab greift, um die maximale Spannung zu messen.
- Aufzeichnung der Aktivität während eines 6-minütigen Geh-Assays.
Hauptergebnisse
- Das System erfasst Abnahmen der willkürlichen Bewegung bei mdx-Mäusen.
- Es unterscheidet genau zwischen Verbesserungen, die auf eine muskelspezifische Wiederherstellung zurückzuführen sind.
- Die Ergebnisse sind über verschiedene Versuche hinweg reproduzierbar.
- Die Methode ist an verschiedene Forschungsumgebungen anpassbar.
Schlussfolgerungen
- Dieser Test eignet sich zur Untersuchung der Muskeldystrophie bei Mäusen.
- Er liefert wertvolle Daten zur Wirksamkeit potenzieller Behandlungen.
- Der Ansatz ist flexibel und kann in unterschiedlichen Forschungsumgebungen eingesetzt werden.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Messung der freiwilligen Fortbewegung bei Mausmodellen liefert einen translationalen Endpunkt für die motorische Funktion bei Muskeldystrophie, der direkt vergleichbar ist mit klinischen Messgrößen wie dem Sechs-Minuten-Gehtest. Dieser kostengünstige, video-basierte Test ermöglicht eine reproduzierbare, nicht-invasive Beurteilung des Krankheitsverlaufs und der therapeutischen Wirkung in präklinischen Studien. Indem er Aktivitätsdefizite bei dystrophindefizienten mdx-Mäusen sowie deren Wiederherstellung durch Utrophin-Expression nachweist, unterstützt das Verfahren die Zielstrukturenvalidierung und die mechanistische Risikominderung in der neuromuskulären Arzneimittelentwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die freiwillige Fortbewegung als funktioneller Parameter für Muskelkraft in dystrophischen Modellen quantifiziert wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die biologische Risikominimierung durch reproduzierbare Genotyp-Phänotyp-Korrelationen bei mdx-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp- und therapierten Gruppen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem wirksame Interventionen (z. B. Utrophin-Transgen) identifiziert werden, die die Aktivitätsniveaus auf Wildtyp-Niveau normalisieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Verbindungsscreening unter Verwendung standardisierter Metriken für die Fortbewegung im offenen Feld vor.
- Reproduzierbarkeit: Liefert quantitative, auf Distanz und Zeit basierende Ergebnisse, die einer Standardisierung des Assays über verschiedene Labore hinweg zugänglich sind.
- Skalierbarkeit: Nutzt kostenlose, quelloffene Software und leicht zugängliche Hardware, um eine Wiederverwendung der Plattform in unterschiedlichen Forschungsumgebungen ohne spezialisierte Ausrüstung zu ermöglichen.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Modelliert patientenrelevante Gehstörungen und schafft so eine translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Klärt, ob beobachtete Effekte auf eine muskelspezifische Wiederherstellung oder unspezifische Aktivitätsänderungen zurückzuführen sind.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem die Wiederherstellung der Gehfähigkeit mit der Zielmolekülbindung und der Modulation des Signalwegs korreliert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich nahtlos in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung ein und schlägt eine funktionelle Brücke zwischen molekularen Mechanismen und phänotypischen Ergebnissen in Modellen der Muskeldystrophie.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem genetische oder pharmakologische Interventionen mit messbaren Veränderungen der willkürlichen Bewegung verknüpft werden.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch reproduzierbares, videobasiertes Tracking, das quantifizierbare Gehendpunkte für die Wirkstoffbewertung erzeugt.
- Analytik: Erzeugt positions- und zeitbezogene Datenströme, die es Teams ermöglichen, die motorische Aktivität über Genotypen, Behandlungen und Zeitpunkte hinweg zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem klinische Gehbeurteilungen nachgebildet werden, was die Abstimmung von Biomarkern und die Erstellung prädiktiver Modelle erleichtert.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare, kostengünstige Kapazität für die Gehtestung und verringert damit die Abhängigkeit von spezialisierten Kerneinrichtungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in motorischen Funktionsanalysen reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch Open-Source-Tracking und kontrollierte Umweltbedingungen.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem der Bedarf an teuren Bewegungsverfolgungssystemen entfällt, während die Datenqualität erhalten bleibt.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung basierend auf der funktionellen Wiederherstellung von Gehphänotypen in präklinischen Modellen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert grundlegende Kenntnisse in der Videografie und in der Nutzung von Open-Source-Tracking-Software (z. B. manuelle Einzelbildausrichtung).
- Basiert auf Standard-Bildgebungsgeräten und konsistenten Umweltbedingungen (Beleuchtung, Temperatur, Tageszeit).
- Erfordert die Einhaltung einheitlicher Protokolle durch alle Teammitglieder, um die Reproduzierbarkeit an verschiedenen Standorten und zwischen verschiedenen Bedienern sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen hinsichtlich unterschiedlicher Kammerngrößen, Mausstämme und Aktivitätsniveaus.
- Beinhaltet Kompromisse zwischen Bildwiederholfrequenz und Messgenauigkeit, da eine Reduzierung der Bildrate die Genauigkeit der Distanzberechnung verringert.
