Eine 3-dimensionale (3D)-gedruckte Vorlage für hohen Durchsatz Zebrafish Embryos anordnen

Diese Methode kann das Verfahren zur Anordnung von Zebrafisch-Embryonen erheblich beschleunigen und den Zebrafisch wirklich für das Hochdurchsatz-Screening geeignet machen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Verwendung einer 3D-gedruckten Schablone, um Zebrafischembryonen in eine 96- oder 384-Well-Matrix zu pre-arrayn, was einen hocheffizienten Plattenvorbereitungsprozess ermöglicht. Wir hatten die Idee für die Methode erst, als wir das Screening von Nanopartikeln durchführten, indem wir einzelne Embryonen manuell in jede Vertiefung einer modularen Platte entnahmen und selektierten, und wollten die Effizienz steigern.

Neben Tianyu wird auch sein Doktorandenkollege Yue Jiang das Verfahren vorführen. Beginnen Sie dieses Verfahren mit dem Entwurf der Arraying-Schablone mit einem 96-Well-Layout von zwölf x acht Pixeln, das auf eine standardmäßige 96-Well-Platte passt. Wie im Textprotokoll beschrieben.

Verwenden Sie einen 3D-Drucker mit einer Genauigkeit von 0,1 Millimetern, um die Vorlage zu drucken. Einige Schlüsselkomponenten der Schablone sind die Einschlusskammer, die Einschlusswanne, die Vakuumkammer und der Lufteinlass. Um das Laichen der Zebrafischembryonen durchzuführen, trennen Sie zuerst Männchen und Weibchen durch eine durchsichtige Plastiktrennwand.

Setzen Sie dann einen Tag vor dem Laichen zwei Paare männlicher und weiblicher Fische pro Paarungsbox ein. Nehmen Sie am Tag des Laichens die Trennwände morgens ab, um männliche und weibliche Fische zu mischen. Entnehmen Sie die männlichen und weiblichen Fische und sammeln Sie die Zebrafischembryonen mit einem feinmaschigen Sieb.

Waschen Sie die Embryonen mit 250 Millilitern Eiwasser. Übertragen Sie die entnommenen Embryonen mit der Holtfreter-Lösung in Petrischale. Entnehmen Sie die toten und unbefruchteten Embryonen mit einem Stereomikroskop.

Legen Sie die Embryonen in einen 28,5 Grad Celsius heißen Inkubator. Beobachten Sie vier Stunden nach der Befruchtung die Embryonen und entfernen Sie alle toten und ungesunden Embryonen. Die Embryonen sind nun bereit für den nächsten Schritt.

Waschen Sie die Schablone zwei- bis dreimal mit 500 Millilitern entionisiertem Wasser, bevor Sie sie für fünf Minuten in den Trockenofen stellen. Kleben Sie dann die untere Kammer mit einem Stück Siegelfolie ab. Schließen Sie eine Vakuumpumpe an den Luftauslass an der Unterseite der Schablone an, um in der durch die Siegelfolie verschlossenen Kammer einen Unterdruck zu erzeugen.

Setzen Sie mit einer Kunststoff-Transferpipette etwa 150 Embryonen in die Schablone ein. Schütteln Sie die gesamte Schablone horizontal, bis in jeder Vertiefung ein Embryo eingeklemmt ist. Bei diesem Schritt ist es wichtig, jeden verfügbaren Zebrafischembryo zu überprüfen und sicherzustellen.

Wenn der Holtfreter-Puffer sehr niedrig war, konnte man durch Schütteln des Templates zusätzlichen Puffer hinzufügen. Entsorgen Sie überschüssige Holtfreter-Lösung und Embryonen, die nicht in den Vertiefungen eingeschlossen sind. Schalten Sie die Vakuumpumpe aus und trennen Sie sie.

Platzieren Sie eine Standardplatte mit 96 Vertiefungen kopfüber gegen die Schablone und drehen Sie beide gleichzeitig. Klopfen Sie auf den Boden der Schablone oder schließen Sie den Luftauslass an eine Druckgas-Staubschutzdose an, um alle gefangenen Embryonen aus der Schablone auf die 96-Well-Platte zu übertragen. Zum Schluss entfernen Sie die Siegelfolie und waschen die Schablone dreimal von oben nach unten mit 500 Millilitern entionisiertem Wasser für die zukünftige Verwendung.

Hier ist das Teilbild einer 96-Well-Platte zu sehen, die von der Schablone angeordnet ist. Umgekehrt zeigt dieses Bild das Teilbild einer manuell angeordneten 96-Well-Platte. Hier wird der allgemeine Gesundheitszustand der Embryonen nach der Plattierung durch manuelle und Arraying-Template-Methoden angezeigt.

Basierend auf den Schlupf-, Überlebens- und Missbildungsraten der Embryonen wurden in beiden Fällen keine signifikanten Auswirkungen auf die allgemeine Gesundheit der Embryonen beobachtet. Sobald diese Technik gemeistert ist, wird eine 96- oder 384-Well-Platte in nur zwei bis drei Minuten vorbereitet, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Forscher, die neuen Eigenschaften dieses Modellorganismus voll auszuschöpfen und ein echtes In-vitro-Hochdurchsatz-Screening zu erreichen.