Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z.B. die Analyse der Struktur und der Funktion des Neokortex. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die großflächige dreidimensionale Struktur im Gehirn aufdecken kann. Obwohl diese Methode Einblicke in den Neokortex geben kann, kann sie auch auf andere Nervensysteme wie das Rückenmark angewendet werden.

Um den Tracer in die Pons der erwachsenen Mäuse zu injizieren, ziehen Sie zunächst einen Mikroliter fluoreszenzmarkiertes Choleratoxin-Untereinheit B in eine 26-Gauge-Hamilton-Spritze. Platzieren Sie eine Injektorpumpe auf der Spritze, dann setzen Sie die Spritze und die Pumpe auf den Werkzeughalter eines Manipulators an einem stereotaktischen Instrument. Kippen Sie den Manipulator um 12 Grad nach hinten von der vertikalen Achse.

Platzieren Sie anschließend die Maus auf dem stereotaktischen Instrument. Entfernen Sie mit einer Rasierklinge die Haare, um eine Infektion zu vermeiden. Schneiden Sie dann 10 Millimeter der Kopfhaut ab, so dass das Bregma und das Lambda sichtbar sind.

Verabreichen Sie 0,1 Milliliter 1%iges Lidocain mit einer Pipette. Stellen Sie den Winkel des Kopfes ein, indem Sie die vertikale Position des Mundstücks auf dem stereotaktischen Instrument so einstellen, dass Bregma und Lambda den gleichen Z-Pegel haben. Passen Sie anschließend die Position des Manipulators an, indem Sie ihn so auf das stereotaktische Instrument schieben, dass sich die Spitze der Spritze in der Nähe des Bregmas befindet.

Notieren Sie die Position des Manipulators. Ziehen Sie die Spritze zurück, indem Sie den Werkzeughalter am Manipulator bewegen. Bewegen Sie den Manipulator anschließend 5,4 Millimeter nach hinten und 0,4 Millimeter seitlich.

Schieben Sie die Spritze so vor, dass sich die Spitze in der Nähe des Eintrittspunkts am Schädel befindet, ziehen Sie dann die Spritze zurück und markieren Sie den Eintrittspunkt. Bohren Sie an der markierten Stelle ein Loch mit einem Durchmesser von etwa einem Millimeter. Führen Sie die Spritzenspitze so durch das Loch ein, dass die Spitzentiefe 6,9 Millimeter höher ist als die am Bregma gemessene.

Injizieren Sie dann einen Mikroliter Tracer mit der Pumpe mit 0,2 Mikrolitern pro Minute. Entfernen Sie nach der Injektion die Spritze aus dem Gehirn. Decken Sie das freiliegende Gehirn bei Bedarf mit kleinen Fragmenten von mikrofibrillärem Blutstiller und Sofortkleber ab.

Wischen Sie das freiliegende Gehirn mit Kochsalzlösung ab, um eine Infektion zu verhindern und die Kopfhaut zu vernähen. Entfernen Sie anschließend die Maus vom stereotaktischen Instrument. Lassen Sie die Maus in einem Inkubator bei 30 Grad Celsius etwa eine Stunde lang von der Narkose erholen.

Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Bringen Sie die Maus in die Gesellschaft anderer Tiere zurück, nachdem sie vollständig geborgen wurde. Um das Hirngewebe zu sammeln, schneiden Sie die Kopfhaut mit einer Schere auf, um den Schädel freizulegen.

Schneiden Sie als Nächstes die Mittellinie des freiliegenden Schädels mit einer Schere ab. Entferne dann den Schädel mit einer Pinzette. Wenn es notwendig ist, die Position von Bregma und Lambda zu markieren, entfernen Sie zuerst eine Seite des Schädels.

Führen Sie dann dünne Wolframnadeln an den Positionen des Bregma und des Lambda in das Gehirn ein und entfernen Sie dann den restlichen Schädel. Platzieren Sie anschließend die Gehirnprobe auf der Vibratom-Plattform. Schneiden Sie die bis zu 500 Mikrometer dicken Abschnitte in PBS bei Raumtemperatur ab.

Übertragen Sie bei diesem Verfahren die Scheiben in ein Fünf-Milliliter-Kunststoffröhrchen mit vier Millilitern Scale S0-Lösung. Dann inkubieren Sie sie 12 Stunden lang unter leichtem Schütteln bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach 12 Stunden die Lösung mit einer Pipette aus dem Röhrchen und fügen Sie vier Milliliter Scale A2-Lösung hinzu.

Inkubieren Sie die Scheiben 36 Stunden lang unter leichtem Schütteln bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach 36 Stunden die Lösung aus dem Röhrchen und fügen Sie vier Milliliter Scale B4-Lösung hinzu. Inkubieren Sie die Scheiben 24 Stunden lang unter leichtem Schütteln bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie nach 24 Stunden die Lösung aus dem Röhrchen und fügen Sie vier Milliliter Scale A2-Lösung hinzu. Inkubieren Sie die Scheiben 12 Stunden lang unter leichtem Schütteln bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach 12 Stunden die Lösung aus der Tube und fügen Sie vier Milliliter PBS hinzu.

Inkubieren Sie die Scheiben sechs Stunden lang unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. Anschließend entnehmen Sie die Scheiben vorsichtig in ein zwei Milliliter langes Plastikröhrchen. Inkubieren Sie sie mit einem Primärantikörper in einem Milliliter AB-Lösung für 48 bis 72 Stunden bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln.

Anschließend entfernst du die Scheiben vorsichtig in ein Fünf-Milliliter-Plastikröhrchen. Inkubieren Sie sie in vier Millilitern AB Scale Lösung für zwei Stunden zweimal bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Anschließend entfernst du die Scheiben vorsichtig in ein zwei Milliliter langes Plastikröhrchen.

Inkubieren Sie mit einem fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper in einem Milliliter AB-Scale-Lösung für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Nehmen Sie die Scheiben vorsichtig in ein Fünf-Milliliter-Plastikröhrchen mit vier Millilitern der Antikörperlösung und inkubieren Sie die Scheiben sechs Stunden lang unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Lösung, fügen Sie vier Milliliter der AB Scale-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Scheiben zwei Stunden lang zweimal unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie dann die Lösung, fügen Sie vier Milliliter 4%iges PFA hinzu und inkubieren Sie die Scheiben eine Stunde lang unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann die Lösung, fügen Sie vier Milliliter PBS hinzu und inkubieren Sie die Scheiben eine Stunde lang unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Lösung, fügen Sie vier Milliliter der Scale S4-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Scheiben 12 Stunden lang unter leichtem Schütteln bei 37 Grad Celsius.

Sie anschließend den Abstandhalter auf einen Objektträger und legen Sie die Scheiben in den Abstandhalter und tauchen Sie die Scheiben in Scale S4-Lösung. Verschließen Sie den Abstandhalter mit einem Deckglas. Geben Sie etwas Wasser auf das Deckglas und belichten Sie die Scheiben mit Hilfe der Konfokal- oder Zwei-Photonen-Mikroskopie mit einem Wasserimmersionsobjektiv mit großem Arbeitsabstand.

In dieser Studie wurden kortikale Projektionsneuronen durch tdTomato-Expression in Tlx3-cre AI9 transgenen Mäusen grün markiert und subzerebrale Projektionsneuronen in Magenta wurden durch Injektion des retrograden Tracers CTB488 in den Pons im Alter von sieben Wochen sichtbar gemacht. Dies ist die Draufsicht, um die ungefähren Positionen der kortikalen Bereiche zu zeigen. Hier sind die Schrägansichten der CTB488-Fluoreszenz, die subzerebrale Projektionsneuronen zeigt, und der tdTomato-Fluoreszenz, die kortikale Projektionsneuronen zeigt, und dies ist das zusammengeführte Bild.

Die Zellkörper der beiden Zelltypen waren über ein breites Spektrum von Hirnarealen sichtbar und optische Schnitte zeigten periodische Mikrosäulen. Dieses Bild zeigt die Zellkörper und apikalen Dendriten von eGFP-exprimierenden subzerebralen Projektionsneuronen im optischen Schnitt einer Crym-eGFP-Maus und dieses Bild zeigt die Parvalbumin-exprimierenden Zellen, die in grün markiert sind, und subzerebrale Projektionsneuronen, die in Magenta markiert sind, indem CTB488 in die Pons einer C57 Black 6-Maus mit der Antikörper-Scale-Methode injiziert wurde. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die 3D-Bildverarbeitung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen wie die quantitative Charakterisierung der Hirnorganisation zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der kortikalen Biologie, um eine neuartige modulare Organisation im Gehirn von Mäusen zu erforschen.