Untersuchung normaler Gewebestrahlungseffekte mit extrazellulären Matrixhydrogelen
24. Juli 2019
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Dezellularisierung und anschließenden Hydrogelbildung von murinen Brustfettpolstern nach ex vivo Bestrahlung dar.
Dieses Protokoll zeigt, dass Strahlung die extrazellulären Matrixeigenschaften des Fettgewebes im murinen Brustfettpad beeinflusst. Die Zugabe von Strahlung in einem Dezellularisierungsmodell wurde bisher nicht durchgeführt. Diese Technik verwendet mehrere Waschschritte, die jeweils einem einzigartigen chemischen Zweck im Dezellularisierungsprozess dienen.
Die Spezifität dieser Technik ermöglicht sanftere chemische Spülungen, um die Gewebeeigenschaften besser zu erhalten. Brustkrebs-Rückfall tritt nach der Therapie auf, vor allem in dreifach negativen Fällen. Die Bewertung, wie die bestrahlte extrazelluläre Matrix das Verhalten von Tumorzellen verändert, führt zu wichtigen Entdeckungen über Rezidivmechanismen.
Nach der Bestrahlung von Proben, mit einer Cäsiumquelle, übertragen Sie die bestrahlten MFP und komplette RPMI-Medien in einen Biosicherheitsschrank. Füllen Sie sechs Zentimeter oder 10 Zentimeter Geschirr mit genügend Medien, um die MFP zu versenken. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius, mit 5% Kohlendioxid, für zwei Tage.
Platzieren Sie zunächst die MFP es in sechs Zentimeter großen Gerichten mit fünf Millilitern Trypsin-EDTA-Lösung. Die Teller mit 70% Ethanol besprühen und abwischen und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius brüten. Verwenden Sie 0,7 Milliliter-Siebe, um die MFP mit entionisiertem Wasser zu waschen, indem Sie dreimal Wasser über das Gewebe gießen.
Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe zwischen den Wärten manuell zu massieren. Als nächstes trocknen Sie das Gewebe bei einem empfindlichen Aufgabentuch kurz und wiegen. Legen Sie das getrocknete Gewebe in einen vorautoklavierten Becher, der einen entsprechend großen Rührstab enthält, und bedecken Sie das Gewebe mit 60 Millilitern 3%t-Octylphenoxypolyethethanol pro Gramm Gewebe.
Eine Stunde bei Raumtemperatur umrühren. Dann den Inhalt des Bechers in ein Sieb werfen. Spülen Sie den Becher mit entionisiertem Wasser und gießen Sie es auf das Gewebe.
Wiederholen Sie diesen Spülvorgang zwei weitere Male, stellen Sie sicher, dass Zangen verwenden, um das Gewebe zwischen den Spülungen manuell zu massieren. Danach das Gewebe bei einem empfindlichen Aufgabentuch kurz trocknen und wiegen. Legen Sie die Gewebe und die Rührstäbe wieder in die gleichen Becher und bedecken Sie sie mit 60 Millilitern 4%Desoxycholsäure pro Gramm Gewebe.
Eine Stunde bei Raumtemperatur umrühren. Als nächstes den Inhalt des Bechers in ein Netzsieb werfen, den Becher mit entionisiertem Wasser abspülen und auf das Gewebe gießen. Wiederholen Sie diesen Spülvorgang zwei weitere Male, stellen Sie sicher, dass Zangen verwenden, um das Gewebe zwischen den Spülungen manuell zu massieren.
Das spülende Gewebe auf einem empfindlichen Aufgabentuch kurz trocknen und abwischen. Legen Sie die getrockneten Gewebe in das gleiche Becherglas, zusammen mit frischem deionisiertem Wasser, ergänzt mit 1%Penicillin-Streptomycin. Den Becher fest mit Paraffinfolie bedecken und bei 4 Grad Celsius über Nacht verlassen.
Am nächsten Tag den Becherinhalt in ein Sieb abtropfen lassen, das Gewebe bei einem empfindlichen Aufgabentuch kurz trocknen und wiegen. Legen Sie dann die MFP es in den gleichen Becher mit einer entsprechenden Größe Rührstange. Bedecken Sie das Gewebe mit 60 Millilitern einer Lösung, die 4% Ethanol und 0,1% Peressigsäure pro Gramm Gewebe enthält.
Bei Raumtemperatur zwei Stunden rühren. Den Inhalt des Bechers in ein 0,7-Millimeter-Sieb zu werfen. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe manuell zu massieren und den Inhalt wieder in den Becher zu legen.
Waschen Sie das Gewebe, indem Sie es mit 60 Millilitern 1X PBS pro Gramm Gewebe bedecken. 15 Minuten bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie diesen gesamten Waschvorgang noch einmal.
Als nächstes entsorgen Sie den Inhalt des Bechers in ein 0,7-Millimeter-Sieb. Mit Zangen das Gewebe manuell massieren und den Inhalt wieder in den Becher legen. Waschen Sie das Gewebe, indem Sie es mit 60 Milliliter entionisiertem Wasser pro Gramm Gewebe bedecken.
15 Minuten bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie diesen gesamten Waschvorgang noch einmal. Das gewaschene Gewebe auf einem empfindlichen Aufgabentuch kurz trocknen und wiegen.
Dump das Gewebe und den Inhalt in ein Sieb und verwenden Zange, um das Gewebe manuell zu massieren. Legen Sie den Inhalt wieder in den Becher und decken Sie das Gewebe mit 60 Millilitern 100%n-Propanol pro Gramm Gewebe ab. Eine Stunde bei Raumtemperatur umrühren.
Dann trocknen Sie das Gewebe auf einem empfindlichen Aufgabentuch kurz und wiegen Sie es. Dump das Gewebe und den Inhalt in ein 0,7-Millimeter-Sieb und verwenden Zange, um das Gewebe manuell zu massieren. Legen Sie den Inhalt wieder in das Becherglas und waschen Sie das Gewebe, indem Sie es mit 60 Milliliter entionisiertem Wasser pro Gramm Gewebe bedecken.
15 Minuten bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang dreimal. Danach das Gewebe bei einer heiklen Aufgabe kurz trocknen und abwischen.
Übertragen Sie das Gewebe in eine beschriftete 15-Milliliter-Röhre und frieren Sie bei negativen 80 Grad Celsius über Nacht ein. Füllen Sie zunächst einen flachen Behälter mit flüssigem Stickstoff. Entfernen Sie die Proben aus dem Gefrierschrank und wiegen Sie jedes lyophilisierte MFP.
Legen Sie eine Probe in den Mörtel, verwenden Sie einen kryogenen Handschuh, um den Mörtel im flüssigen Stickstoff zu halten. Verwenden Sie dann einen Stößel, der an einem Handbohrer befestigt ist, um die Probe zu fräsen. Fräsen Sie in einem Minutentakt, um den Fortschritt zu überprüfen und die handgeliebte Hand aus dem flüssigen Stickstoff zu entfernen.
Wiederholen Sie diesen Fräsvorgang für alle Proben, und achten Sie darauf, den Mörtel und den Stößel mit Ethanol zwischen jeder Probe zu sprühen und abzuwischen. Bewahren Sie die pulverförmigen Proben in 15 Milliliter-Rohren bei minus 80 Grad Celsius auf, bis sie einsatzbereit sind. Zunächst die Proben aus dem Gefrierschrank nehmen und bei Raumtemperatur auftauen.
Während die Proben auftauen, mischen Sie Pepsin in Salzsäure, um eine Pepsin-HCL-Lösung zu bilden. Als nächstes Probenpulver und die Pepsin-HCL-Lösung in ein 15-Milliliter-Rohr geben, einen kleinen Rührstab hinzufügen und 48 Stunden rühren. Danach die Rohre für fünf Minuten auf Eis legen.
Fügen Sie jeder Probe 10X PBS hinzu, sodass die endgültige Lösung eine Konzentration von 1X PBS aufweist. Fügen Sie dann 10% Volumen/Volumen, 0,1 molches Natriumhydroxid zu jeder Lösung hinzu, um pH 7,4 zu erreichen, wobei pH-Papier verwendet wird, um jede Lösung einzeln zu testen. Mit einer pH 7,4-Gel-Lösung setzen Sie das pelletierte GFP und die mit 4T1-Zellen gekennzeichnete Luziferase auf eine Konzentration von entweder 500, 000 oder 1 000 000 Zellen pro Milliliter Gellösung aus.
Fügen Sie 16 Mikroliter Gelzelllösung zu jedem Brunnen einer 16-Well-Kammerrutsche hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Danach fügen Sie 100 Mikroliter komplette RPMI-Medien zu jedem Brunnen hinzu. Weiter bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden inkubieren.
Verwenden Sie dann ein Fluoreszenzmikroskop, um die Zellen bei einer Anregungswellenlänge von 519 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 618 Nanometern zu beobachten. In dieser Studie werden normale Gewebestrahlungseffekte mit extrazellulären Matrixhydrogelen untersucht. Hämatoxylin und Eosin Färbung wird verwendet, um die Dezellularisierung zu bestätigen, durch den Verlust von Kernen und anderen Spuren von DNA.
Während Oil Red O Färbung verwendet wird, um den Lipidgehalt zu bewerten und die Retention einer Dipasitmorphologie zu bestätigen. Die rheologischen Eigenschaften der ECM-Hydrogele werden bei 37 Grad Celsius bewertet. Der Speichermodul ist höher als der Verlustmodul für alle Bedingungen, was eine stabile Hydrogelbildung zeigt.
GFP und Luziferase mit der Bezeichnung 4T1-Mammakarzinomzellen werden dann in den Hydrogelen verkapselt. Die Zellproliferation wird 48 Stunden nach der Verkapselung durch Fluoreszenzmikroskopie, durch Beleuchtungsmessung und Lebensfähigkeitsfärbung untersucht. Bestrahlte Hydrogele zeigen einen zunehmenden Trend bei der Tumorzellproliferation.
Phalloidin-Konjugat wird verwendet, um F-Actin in den gekapselten Zellen zu visualisieren. Denken Sie daran, den Mörtel zu kühlen, bevor Sie das Gewebe in der Mühle platzieren, ein warmer Mörtel kann zu unvollständigem Fräsen führen. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit n-Propanal und Pepsin, nur öffnen n-propanal und andere dezellularisationäre Mittel unter einer chemischen Haube.
Wiegen Sie das Pepsin nach Möglichkeit unter einer chemischen Haube, da die Gefahr des Einatmens besteht. ECM-Zusammensetzungsänderungen nach Bestrahlung und Dezellularisierung können mittels Massenspektrometrie und Raman-Spektroskopie ausgewertet werden. Darüber hinaus kann die Faserstruktur der ECM-Hydrogele durch Rasterelektronenmikroskopie analysiert werden.
Diese Methode hat das Potenzial, erweitert zu werden, um die Auswirkungen von Strahlung auf nicht nur Tumorzellen, sondern auch Immunzellen, sowie Gewebe, die Strahlenschäden erleben, als Ergebnis der Therapie zu untersuchen. Diese Dezellularisierungstechnik wird es den Forschern ermöglichen, die extrazellulären Matrixeigenschaften des Gewebes nach der Strahlung zu bewerten, was bei den meisten Krebsarten eine wichtige Behandlungsoption ist.
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Übersicht
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Entzellularisierung und anschließenden Hydrogel-Bildung muriner Brustfettgewebe nach ex vivo Bestrahlung vor. Die Technik ermöglicht schonendere chemische Waschungen, um die Gewebeeigenschaften besser zu erhalten, was entscheidend ist, um die Auswirkungen der Strahlung auf die Eigenschaften der extrazellulären Matrix zu untersuchen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Onkologie
Hintergrund
- Strahlung beeinflusst die Eigenschaften der extrazellulären Matrix im Fettgewebe.
- Bisher wurden Strahlungseinwirkungen in Dekellularisierungsmodelle nicht einbezogen.
- Ein Rezidiv von Brustkrebs ist eine erhebliche klinische Herausforderung, insbesondere bei triple-negativen Fällen.
- Das Verständnis der Wirkung bestrahlter extrazellulärer Matrix kann Aufschluss über Rezidivmechanismen geben.
Zweck der Studie
- Untersuchung, wie Strahlung die extrazelluläre Matrix in murinen Brustfettgeweben beeinflusst.
- Entwicklung einer Dekellularisierungsmethode, die die Geweeigenschaften erhält.
- Untersuchung der Auswirkungen der bestrahlten extrazellulären Matrix auf das Verhalten von Tumorzellen.
Verwendete Methoden
- Protokoll zur Entzellularisierung mit spezifischen Waschschritten.
- Ex-vivo-Bestrahlung muriner Brustfettgewebeareale.
- Bildung von Hydrogelen aus entzellularisiertem Gewebe.
- Beurteilung der Eigenschaften der extrazellulären Matrix nach Bestrahlung.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll decellularisiert murine Brustfettgewebe erfolgreich.
- Strahlung verändert die Eigenschaften der extrazellulären Matrix.
- Sanftere chemische Spülungen bewahren wichtige Gewebemerkmale.
- Die gewonnenen Erkenntnisse könnten Strategien zur Verhinderung von Brustkrebsrezidiven unterstützen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt eine neuartige Methode zur Untersuchung bestrahlten Fettgewebes vor.
- Die Ergebnisse könnten zu einem besseren Verständnis der Mechanismen der Tumorrezidivbildung führen.
- Der Ansatz kann auf weitere Forschungsarbeiten in der Krebsbiologie angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Das Verständnis, wie Strahlung die extrazelluläre Matrix in gesundem Brustgewebe verändert, liefert mechanistische Einblicke in das lokale Tumorrezidiv, eine entscheidende Herausforderung in der Therapie des triple-negativen Brustkrebses. Diese Methode ermöglicht die in-vitro-Modellierung bestrahlter Gewebemikroumgebungen, um die Zielvalidierung und Assay-Entwicklung sicherer zu gestalten, indem Veränderungen der ECM mit der Proliferation von Tumorzellen und der Reorganisation des Zytoskeletts verknüpft werden. Sie erhöht die Vorhersagekraft präklinischer Modelle, indem sie den Beitrag des Stroma zur Therapieresistenz und Krankheitsrezidiven erfasst.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht, wie bestrahlte stromale ECM das Verhalten von Tumorzellen beeinflusst, um den Beitrag der Mikroumgebung bei der therapeutischen Resistenz zu klären.
- Operativer Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung stromaler Zielstrukturen durch die Beurteilung der Proliferation von Tumorzellen und der Organisation des Cytoskeletts in physiologisch relevanten Hydrogelen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare Hydrogele mit quantifizierbaren rheologischen und biochemischen Ausgangsparametern für die Wirkstoffscreening in bestrahlten Mikroumgebungen.
- Operativer Wert: Unterstützt die Skalierbarkeit und Wiederverwendbarkeit von Assays durch die Lagerung lyophilisierter ECM-Pulver und kontrollierte Rehydratation für konsistente experimentelle Bedingungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Modelliert krankheitsrelevante Stroma-Tumor-Interaktionen nach Bestrahlung, um mechanistische Entschärfung von therapeutischen Kandidaten zu bewerten.
- Operationaler Wert: Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die native ECM-Architektur und -Zusammensetzung nach Bestrahlung und Entzellularisierung erhalten bleibt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie eine justierbare stromale Plattform bereitstellt, die strahleninduzierte Veränderungen der ECM mit Tumorzellphänotypen verknüpft und somit die Identifizierung von Leitverbindungen sowie Entscheidungen über den präklinischen Fortschritt unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung stromavermittelter Resistenzmechanismen, indem kontrollierte Vergleiche zwischen bestrahlter und nicht bestrahlter ECM hinsichtlich des Tumorzellverhaltens ermöglicht werden.
- Screening: Bietet assaysbereite Hydrogele mit messbaren Proliferations- und zytoskelettalen Endpunkten zur Bewertung von Modulatoreffekten in einem standardisierten Mikroumfeld.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse wie Fluoreszenzintensität, Lumineszenz und rheologische Parameter, um Bedingungen zu vergleichen und den Einfluss des Stromas auf Tumorphänotypen zu bewerten.
- Translationale Forschung: Modelliert die Wechselwirkung zwischen Stroma und Tumor in bestrahltem Gewebe, um mit der präklinischen Evaluierung von Wirkstoffen gegen mikroumgebungsbedingte Rezidivtreiber übereinzustimmen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Ermöglicht die Plattformstandardisierung durch lyophilisierte ECM-Lagerung und damit reproduzierbare Hydrogelherstellung über verschiedene Teams und Zeitpunkte hinweg für longitudinale Stromauntersuchungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem stromale Beiträge zur Tumorrezidivierung modelliert und mechanistische Unschärfen in bestrahlten Mikroumgebungen reduziert werden.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Schritte der Entzellularisierung, Bestrahlung und Hydrogelbildung mit definierten Spül- und Reagenzparametern.
- Strategischer Wert: Verbessert die Go/No-Go-Entscheidungen, indem stromale Zielstrukturen identifiziert werden, die das Tumorzellverhalten nach Bestrahlung modulieren, und späte biologische Risiken verringert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Therapeutika basierend auf deren Wirksamkeit in bestrahlten stromalen Kontexten, die klinischen Rezidivszenarien nachahmen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Entzellularisierung von Geweben, im Umgang mit Hydrogelen sowie in fluoreszenzbasierten Assays zur Zellviabilität und zum Zytoskelett.
- Setzt Zugang zu Bestrahlungsanlagen (z. B. Cäsiumquelle), Rheometern und Mikroskopiesystemen für Proliferations- und F-Aktin-Aufnahmen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bei der Gewebebeschaffung, der Dosierung der Bestrahlung und der Herstellung der Hydrogele, um experimentelle Konsistenz sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf andere Gewebetypen oder stromale Quellen außerhalb muriner Brustfettgewebe angewendet wird.
- Ist durch den murinen Ursprung der ECM begrenzt, was eine Validierung in für den Menschen relevanten stromalen Modellen für translationale Übertragungen erforderlich machen kann.
