Untersuchung der Auswirkungen von Matrix Stiffness auf Cellular-Funktion mit Acrylamid-basierte Hydrogele
10. August 2010
Die Wirkung von Substraten Steifigkeit auf die zelluläre Funktion modelliert werden kann In-vitro- Verwendung von Polyacrylamid-Hydrogele unterschiedlicher nachzubessern.
Um die Compliance von lebendem Gewebe mithilfe von Acrylamidhydrogelen zu modellieren. Dies wird zunächst durch die Herstellung reaktiver unterer Deckgläser und silikonisierter oberer Deckgläser erreicht. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Acrylamidhydrogele einzugiessen und zu erzeugen.
Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das gewünschte extrazelluläre Matrixprotein an das Hydrogel zu vernetzen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Inkubation und Analyse von Zellen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, wie die Variation der Steifigkeit der extrazellulären Matrix in vitro das Zellverhalten über Analysen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie, Echtzeit-quantitativer PCR und Western Blotting reguliert.
Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Herstellung und Anwendung von Acrylamid-Hydrogelen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um zu untersuchen, wie die Steifigkeit der extrazellulären Matrix die Zellmorphologie, Zellsignalgebung und Proliferation reguliert. Beginnen wir also.
Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Herstellung reaktiver Deckgläser. Bringen Sie zunächst eine Schicht Paraform auf der unteren Hälfte einer 150 Millimeter großen Petrischale an. Überführen Sie anschließend bis zu neun autoklavierte 25-Millimeter-Deckgläser auf die Parafolie und bedecken Sie sie mit einem Milliliter 0,1-molarer Natronlauge.
Inkubieren Sie die Deckgläser drei Minuten lang. Nach der Inkubation saugen Sie das Natriumhydroxid mit einer Vakuumleitung unter Verwendung einer chemischen Abzugshaube ab und pipettieren Sie 0,5 Milliliter Dreiaminoprofiltrimethylsilan oder 3 A-P-T-M-S auf jedes Deckglas. Inkubieren Sie die Deckgläser weitere drei Minuten und saugen Sie anschließend das 3 A-P-T-M-S ab. Achten Sie darauf, die Inkubationszeit nicht zu verlängern, um die Bildung von Schaum auf dem Deckglas zu vermeiden.
Scheiben nach der Behandlung. Spülen Sie die Deckgläser einmal mit 20 Milliliter entionisiertem Wasser in derselben Schale. Entfernen Sie die Deckgläser mit einer gebogenen Pinzette aus der Schale und überführen Sie sie mit der behandelten Seite nach oben in eine neue 150-Millimeter-Schale.
Anschließend die Deckgläser erneut mit entionisiertem Wasser waschen und 10 Minuten lang auf den Schüttler stellen. Nach der Inkubation das Wasser entfernen und weitere zwei Male spülen. Es ist sehr wichtig, das gesamte 3-A-P-T-M-S vollständig zu entfernen, damit es nicht mit dem Glutaraldehyd reagiert und 10 Minuten vor der Verwendung von Glutaraldehyd einen trüben weißen Niederschlag bildet.
Überführen Sie die Deckgläser mit gebogenen Pinzetten in eine saubere Schale, die mit Paraffin ausgelegt ist, und aspirieren Sie die restliche Flüssigkeit mithilfe einer Vakuumleitung. Bedecken Sie anschließend jedes Deckglas vollständig mit 0,5 Millilitern 0,5 %iger Glutaraldehydlösung in steriler entionisierter Wasser, um die drei A-P-T-M-S und das Polyacrylamidgel zu vernetzen. Inkubieren Sie die Deckgläser 30 Minuten lang in einem Abzug. Danach aspirieren Sie die Glutaraldehydlösung und waschen die Deckgläser erneut mit entionisiertem Wasser.
Anschließend die Deckgläser vollständig trocknen. Neue Deckgläser in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen mit einer 10%igen Oberflächenversiegelungslösung in Chloroform geben und mindestens 10 Minuten lang schwenken. Die Oberflächenversiegelungslösung abgießen und lufttrocknen lassen.
Legen Sie die Deckgläser auf Kim-Tücher in dem生物ischen Sicherheitswerkbank, wo die Hydrogele vorbereitet werden, um mit der Hydrogelpräparation zu beginnen. Verwenden Sie gebogene Pinzetten, um die Deckgläser mit der reaktiven Seite nach oben auf ein Blatt Paraform zu übertragen, das an der Oberfläche der生物ischen Sicherheitswerkbank befestigt wurde. Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser flach auf der Paraform-Oberfläche liegen.
Dann bereiten Sie eine gesättigte und hydroxy CIN-Hilfsstoff- oder NHS-Lösung in Toluol vor, indem Sie eine kleine Menge NHS in ausreichend Toluol lösen. Für die spezifischen Experimente geben Sie kleine Mengen NHS hinzu, bis das NHS nicht mehr löslich ist. Die gesättigte Lösung ist gewöhnlich trüb und rosa.
Bereiten Sie anschließend das Acrylamid, BIS, Acrylamidwasser und ein PS vor, um den gewünschten Acrylamidgehalt zu erreichen. Geben Sie die Reagenzien gemäß dem schriftlichen Protokoll in die Mikroverbrauchsgefäße. Dann jeweils eine Aliquotprobe nach der anderen.
Fügen Sie das NHS und TM hinzu. Vortexen Sie das Röhrchen kurz und geben Sie sofort zwischen drei und fünf Gelen mit jeweils 140 Mikrolitern pro Deckglas in den biologischen Sicherheitswerkbänken ab. Platzieren Sie schnell das silanisierte 25-Millimeter-Deckglas auf jedes Gel, bevor es mit der Polymerisation beginnt.
Das Hinzufügen der oberen Deckglas ermöglicht es dem Acrylamid, das untere Deckglas vollständig zu bedecken. Inkubieren Sie dieses Sandwich bei Raumtemperatur, bis das Acrylamid polymerisiert ist, um festzustellen, wann die Polymerisation erfolgt ist. Überprüfen Sie die restliche Acrylamidlösung im Mikrozentrifugenröhrchen.
Die Polymerisation dauert einige Minuten bei steifen Gele und etwas länger bei weichen Gele. Sobald die Polymerisation abgeschlossen ist, heben Sie das Sandwich vorsichtig auf, wobei Sie sterile Handschuhe tragen. Danach schieben Sie die obere Deckglasplatte so weit zur Seite, bis sie über das polymerisierte Gel hinausragt.
Hebeln Sie dann die Abdeckung ab. Ziehen Sie das Gel ab und entsorgen Sie den oberen Deckel. Legen Sie jeden unteren Gel-Deckel, im Folgenden als Hydrogel bezeichnet, in eine sechswellige Platte.
Fügen Sie anschließend zwei Milliliter gepufferte Phosphatlösung oder PBS pro Vertiefung einer sechswelligen Platte hinzu. Waschen Sie die Hydrogels dann mit PBS und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang auf einem Schüttler. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zwei Mal.
Um das Experiment zu beginnen, bedecken Sie jedes Hydrogel mit zwei Milliliter einer Fibronectin-Lösung oder eines anderen extrazellulären Matrixproteins. Inkubieren Sie das Protein über Nacht bei vier Grad Celsius auf dem Hydrogel, damit es kovalent an das Hydrogel binden kann. Nach der Übernacht-Inkubation aspirieren Sie die ECM-Lösung. Dann blockieren Sie die nicht reaktiven NHS-Gruppen mit einem Milligramm pro Milliliter hitzeaktiviertem fettfreiem bovinem Serumalbumin in serumfreiem Medium und inkubieren für mindestens 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Nach der Inkubation die Hydrogele einmal mit steriler PBS waschen. Anschließend die Zellen in das geeignete Kulturmedium, das fetalen Kälberserum enthält, auf die Hydrogele hier aussäen.
Etablierte murine embryonale Fibroblasten werden verwendet. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen, die auf dem Hydrogel ausgesät werden sollen, basierend auf dem erforderlichen Grad der Zellausbreitung und Konfluenz für die Experimente. Für die Western-Blot- und quantitative PCR-Analyse sind etwa 10^5 Zellen erforderlich.
Anschießend inkubieren Sie die Zellen unter den für den jeweiligen Zelltyp geeigneten Bedingungen. Nach der Inkubationszeit extrahieren Sie das zelluläre Protein oder mRNA je nach Bedarf.
Pipettieren Sie 100-Mikroliter-Tropfen Lysepuffer auf ein Paraform-Blatt auf der Laborbank und lassen Sie zwischen den einzelnen Tropfen etwa zwei bis drei Zentimeter Abstand. Entfernen Sie anschließend vorsichtig jedes Hydrogel, indem Sie die untere Deckglasabdeckung aus der Vertiefung anheben. Verwenden Sie dazu gebogene Pinzette und legen Sie das Hydrogel mit der Zellseite nach unten auf die Tropfen.
Inkubieren Sie die Zellen mit dem Lysepuffer genau eine Minute lang. Entfernen Sie abschließend die Deckgläser und überführen Sie den Lysepuffer in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Alternativ überführen Sie bei der RNA-Extraktion jedes Hydrogel in eine neue sechswellige Platte und geben je Vertiefung ein Milliliter Triazol hinzu.
Die Gele nach der Inkubation drei Minuten lang inkubieren. Die Triazollösung zur Aufbewahrung in ein Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen. Eine gründliche Wäsche der Deckgläser nach Zugabe von A-P-T-M-S ist ein wichtiger Schritt zur Herstellung reaktiver Deckgläser.
Korrekt gereinigte und trockene Deckgläser sind frei von jeglichen Präzipitaten-Rückständen. A-P-T-M-S reagiert mit Glutaraldehyd und bildet einen weißen, trüben Niederschlag. Tritt ein Niederschlag auf, muss das gesamte Verfahren wiederholt werden, da das Deckglas nicht mehr verwendbar ist.
Nach der Hydrogelbildung und Beschichtung mit ECM-Proteinen werden die Zellen über Nacht ausgesät. Es gibt einen deutlichen Unterschied im Auswachsen der Zellen auf steifen im Vergleich zu weichen Hydrogelen, wie durch die Faltung bei der Färbung sichtbar wird, und mausembryonale Fibroblasten breiten sich stärker auf steifen im Vergleich zu weichen Hydrogelen aus. Tatsächlich bleiben die meisten Zellen, die an einem weichen Hydrogel anhaften, kompakt und haften weniger effizient an.
Repräsentative Ergebnisse der quantitativen PCR zur Cyclin-D1-mRNA-Expression in murinen embryonalen Fibroblasten zeigen, dass Cyclin D1 auf einer steifen Matrix signifikant hochreguliert ist, nicht jedoch auf einer weichen Matrix. Dies legt nahe, dass die Steifheit der Matrix den Zellzyklusfortschritt in vitro reguliert. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit herstellt, um physiologische Bedingungen in vivo zu modellieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, zusätzliche reaktive Deckgläser anzufertigen, da Unfälle und Fehler auftreten können.
Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Diese Studie untersucht den Einfluss der Steifheit von Substraten auf die zelluläre Funktion unter Verwendung von Polyacrylamidhydrogelen. Die Methodik umfasst die Herstellung von Hydrogelen mit unterschiedlicher Compliance, um die Gewebekonditionen in vivo zu modellieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Biomaterialien
- Gewebetechnik
Hintergrund
- Das Zellverhalten wird durch die mechanischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix beeinflusst.
- Polyacrylamidhydrogelen können die Steifheit biologischer Gewebe nachahmen.
- Das Verständnis dieser Wechselwirkungen ist entscheidend für Anwendungen im Gewebeengineering.
- Die Analyse erfolgt mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und PCR-Techniken.
Zweck der Studie
- Modellierung der Gewebekompatibilität in vivo im Laborversuch (in vitro).
- Untersuchung, wie sich die Veränderung der Kompatibilität der extrazellulären Matrix auf das Zellverhalten auswirkt.
- Gewinnung von Erkenntnissen über die zellulären Reaktionen auf mechanische Reize.
Verwendete Methoden
- Herstellung reaktiver unterer Deckgläser und silanisierter oberer Deckgläser.
- Erzeugung von Acrylamid-Hydrogelen mit unterschiedlichen Steifigkeitsstufen.
- Vernetzung von extrazellulären Matrixproteinen an die Hydrogele.
- Bebrütung und Analyse von Zellen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie, Echtzeit-quantitativer PCR und Western Blotting.
Hauptergebnisse
- Die Ergebnisse zeigen, wie die Steifigkeit der extrazellulären Matrix das Zellverhalten reguliert.
- Die Immunfluoreszenzmikroskopie zeigt Veränderungen in der Zellmorphologie.
- Die Echtzeit-quantitative PCR weist Variationen in der Genexpression nach, die mit der Steifigkeit korrelieren.
- Die Western-Blot-Analyse bestätigt Änderungen in der Proteinexpression als Reaktion auf die Compliance des Substrats.
Schlussfolgerungen
- Die Steifheit des Substrats beeinflusst zelluläre Funktionen erheblich.
- Polyacrylamidhydrogelen eignen sich gut zur Modellierung der Gewebekomplianz.
- Die Ergebnisse haben Auswirkungen auf das Gewebeengineering und die regenerative Medizin.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Modellierung der Gewebesteifigkeit in vitro ermöglicht eine mechanistische Entschärfung therapeutischer Zielstrukturen, indem die Compliance der extrazellulären Matrix mit zellulären Phänotypen verknüpft wird. Dieser Ansatz unterstützt die Zielstruktur-Validierung bei Fibrose, Onkologie und kardiovaskulären Erkrankungen, indem er krankheitsrelevante Systeme bereitstellt, die zelluläre Reaktionen auf biomechanische Reize vorhersagen können. Die Integration hydrogelbasierter Plattformen in einem frühen Stadium der Forschung erhöht die Vorhersagegenauigkeit und ermöglicht eine Portfolio-Priorisierung basierend auf pathophysiologischer Relevanz.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersuchung therapeutischer Hypothesen durch Bewertung, wie die Matrixsteifigkeit Signalwege reguliert, die an Proliferation und Fibrose beteiligt sind.
- Operativer Wert: Funktionale Zielvalidierung ermöglichen, indem krankheitsrelevante Steifigkeitsbedingungen verwendet werden, die in-vivo-Mikroumgebungen nachahmen.
- Prädiktiver Wert: Die präklinische Entscheidungsfindung unterstützen, indem Zielstrukturen identifiziert werden, deren Aktivität durch die Compliance der extrazellulären Matrix moduliert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereiten Sie standardisierte Hydrogele vor, die mit ECM-Proteinen beschichtet sind, um reproduzierbare Substrate für die Wirkstoffscreening-Untersuchungen zu schaffen.
- Quantitative Ausgangsgrößen: Generieren Sie messbare Endpunkte wie Genexpression (mittels qPCR) und Proteinspiegel (mittels Western Blot), die mit steifigkeitsabhängigen Phänotypen korrelieren.
- Skalierbarkeit des Screenings: Ermöglichen Sie die Bewertung pharmakologischer Wirkstoffe über einen Bereich gewebemimetischer Elastizitäten hinweg, um kontextspezifische Wirksamkeit zu identifizieren.
Translationale und präklinische Forschung
- Bedeutung für die Krankheitsforschung: Modellieren Sie Fibrosen, Tumorstroma und Bedingungen der vaskulären Versteifung, indem Sie die Elastizität des Hydrogels auf pathophysiologische Bereiche abstimmen.
- Übertragbare Kontinuität: Verknüpfen Sie Entdeckungs- und präklinische Arbeitsabläufe, indem Sie in den Phasen der Zielvalidierung und der Leitstrukturoptimierung konsistente, steifigkeitsdefinierte Systeme verwenden.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützen Sie Go/No-Go-Entscheidungen dadurch, dass überprüft wird, ob die Wirkstoffeffekte unter physiologisch relevanten mechanischen Reizen erhalten bleiben.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung eines Zielmoleküls bis zur präklinischen Validierung ein, insbesondere für mechanosensitive Signalwege bei Fibrose und Krebs.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen, indem sie die Matrixsteifigkeit mit Veränderungen der Cyclin-D1-Expression und des Zellzyklusfortschritts verknüpft.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch justierbare Hydrogelsteifigkeit und konsistente Beschichtung mit ECM-Proteinen zur zuverlässigen Beurteilung der Wirkstoffantwort.
- Analytik: Bietet quantitative Auswertungen mittels Immunfluoreszenz, qPCR und Western Blotting, um zelluläre Reaktionen unter verschiedenen Steifigkeitsbedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet frühe Erkenntnisse mit präklinischen Modellen, indem Steifigkeitsbereiche verwendet werden, die krankhaften Geweben wie fibrotischer Leber oder Tumoren entsprechen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine einstellbare, wiederverwendbare Plattform zur Evaluierung von Zielstrukturen in mehreren Krankheitsbereichen, in denen eine Umgestaltung der extrazellulären Matrix ein charakteristisches Merkmal ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten, indem die Matrixsteifigkeit als Variable für das Zellverhalten und die Zielstrukturenbindung isoliert wird.
- Operativer Wert: Gewährleistet Reproduzierbarkeit durch standardisierte Protokolle zur Herstellung von Hydrogelen und zur Vernetzung von Proteinen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem Zielstrukturen früh entlastet werden, basierend auf ihrer Empfindlichkeit gegenüber biomechanischem Kontext.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen, die ihre Aktivität über physiologische und pathologische Steifigkeitsbereiche hinweg beibehalten.
Durchlegungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Herstellung von Biomaterialien und Oberflächenchemie zur Erzeugung reaktiver Deckgläser.
- Hängt vom Zugang zu Rheometrie oder AFM zur Überprüfung der Steifigkeit und zur Gewährleistung der Konsistenz zwischen Chargen ab.
- Erfordert die Standardisierung der Schritte zur Beschichtung mit ECM-Proteinen und zum Blockieren, um eine gleichmäßige Präsentation von Liganden sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Übergang des Systems auf verschiedene Zelltypen oder 3D-Kultivierungsformate.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Delaminierung des Hydrogels, falls die Waschschritte unzureichend sind oder die Vernetzung mit Glutaraldehyd unvollständig ist.
