Optimierung, Design und Vermeidung von Fallstricken in der manuellen Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie

Multiplexfluoreszenz-Immunhistochemie identifiziert mehrere Zelltypen und ihre Positionen in intaktem formalinfixiertem Paraffin-eingebettetem Gewebe, was nicht nur die Zellidentifizierung, sondern auch die räumliche Analyse von Zellen zu Zell ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser manuellen Technik ist die Verwendung mehrerer Antikörper der gleichen Art ohne Kreuzreaktivität. Diese Technik ermöglicht einen tiefen Einblick in die Wechselwirkungen von Immun- und Krebszellen in der Tumormikroumgebung.

Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, lassen Sie etwa drei bis vier Tage Färbung und verfolgen Sie jeden Schritt während des Prozesses vollständig. Eine schwächere Methode des Färbeprozesses und Multiplex-Design ist entscheidend, um häufige und erwartete Fallstricke zu verringern. Beginnen Sie mit der Deparaffinisierung und Rehydratisierung der Dias.

Legen Sie sie im Hybridisierungsofen mit Gewebeseite nach oben und backen Sie sie bei 60 Grad Celsius für eine Stunde. Nehmen Sie die Rutschen aus dem Ofen und lassen Sie sie für fünf bis 10 Minuten in einem vertikalen Schiebeträger abkühlen. Verwenden Sie dann ein Dia-Färbeset, um die Dias dreimal mit Xylol und einmal mit 100% Ethanol, 95% Ethanol und 70% Ethanol für jeweils 10 Minuten zu behandeln.

Waschen Sie das Zahnradregal mit entionisiertem Wasser und fixieren Sie die Dias, indem Sie sie 30 Minuten lang in neutral gepuffertes Formalin eintauchen. Waschen Sie die Rutschen mit Wasser für zwei Minuten und fahren Sie mit Antigen-Retrieval fort. Legen Sie das Zahnradregal in eine hitzebeständige Box, die mit pH 6,0 oder pH 9,0 Antigen-Abrufpuffer gefüllt ist.

Bedecken Sie die Box mit Plastikfolie und befestigen Sie sie mit einem Gummiband. Legen Sie die Box in eine mit Wechselrichtern ausgestattete Mikrowelle am Rand der rotierenden Platte und erhitzen Sie die Dias 45 Sekunden lang mit 100 % Leistung, gefolgt von 15 Minuten bei 20 % Leistung. Lassen Sie die Dias nach dem Microwaving 15 bis 20 Minuten abkühlen.

In der Zwischenzeit bereiten Sie Arbeitslösungen von Antikörpern und Fluorophoren vor. Bereiten Sie das primäre Antikörperverdünnungsmittel vor, indem Sie 0,5 Gramm Rinderserumalbumengranulat in 50 Milliliter TBST oder 1X PBS auflösen. Verdünnen Sie jede primäre Antikörperarbeitslösung auf eine zuvor festgelegte optimierte Konzentration.

Verdünnen Sie jedes Fluorophor im Fluorophor-Verdünnungsstoff in einer Konzentration von eins bis 100. Bereiten Sie am letzten Tag der Färbung die DAPI-Arbeitslösung vor, indem Sie drei Tropfen DAPI zu einem Milliliter TBST hinzufügen. Sobald die Dias abgekühlt sind, entfernen Sie sie aus der Mikrowelle und nehmen Sie die Plastikfolie ab.

Waschen Sie sie mit entionisiertem Wasser für zwei Minuten, gefolgt von einer zweiminütigen Wäsche mit TBST. Nach dem Waschen trocknen Sie den Schlitten um das Gewebe mit einer empfindlichen Aufgabe wischen und verfolgen um die Außenseite des Gewebes mit einem hydrophoben Barriere-Stift, wobei darauf geachtet wird, das Gewebe nicht zu berühren oder es austrocknen zu lassen. Legen Sie jede Rutsche in die Luftbefeuchterkammer und fügen Sie dem Gewebe etwa vier Tropfen Blockierlösung hinzu.

Dann inkubieren Sie die Dias für 10 Minuten bei Raumtemperatur und fahren Sie mit der primären Antikörperanwendung fort. Entfernen Sie die blockierende Lösung von jeder Folie, indem Sie auf einem Stapel Papierhandtücher auf die Seite der Folie tippen, und verwenden Sie eine empfindliche Aufgabenlöschung, um die verbleibende Lösung zu entfernen. Legen Sie das Dia wieder in die befeuchtete Kammer, fügen Sie etwa 200 Mikroliter des arbeitenden Primärantikörpers hinzu und brüten Sie eine Stunde lang an.

Waschen Sie die Dias nach der Inkubation dreimal, indem Sie sie zwei Minuten pro Wäsche in TBST untertauchen. Die verbleibenden TBST von jeder Rutsche abziehen und etwa drei bis vier Tropfen Sekundärantikörper auftragen. Inkubieren Sie die Dias in der befeuchteten Kammer für 10 Minuten.

Waschen Sie die Dias erneut mit TBST und wenden Sie ca. 100 Mikroliter der Fluorophor-Arbeitslösung auf. Die Dias in die befeuchtete Kammer zurückgeben und 10 Minuten inkubieren. Wiederholen Sie die TBST-Wäsche und mikrowellen Sie dann die Dias entsprechend den Manuskriptanweisungen, um die Antikörper zu entfernen.

Eine wichtige Sache, die Sie während dieses mehrtägigen Färbungsprozesses in Erinnerung bleiben sollten, ist das Anhalten nach dem Mikrowaving-Schritt und das Verlassen der Dias im Antigen-Retrievalpuffer über Nacht, wodurch Gewebe- und Fleckenintegrität gewährleistet wird. Entfernen Sie die letzte Antikörperanwendung mit der Antigen-Retrieval-Lösung und waschen Sie die Dias mit entionisiertem Wasser, gefolgt von TBST für zwei Minuten pro Waschgang. Wiederholen Sie die Färbungsschritte für die restlichen Antikörper-Flurophor-Paare, und fahren Sie dann mit der DAPI-Anwendung fort.

Tragen Sie ca. 150 Mikroliter Arbeits-DAPI-Lösung auf jede Rutsche auf und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang in der befeuchteten Kammer. Nach der Inkubation die Dias ca. 30 Sekunden mit TBST waschen und die Deckelrutschen montieren. Sobald das Montagemedium getrocknet ist, wenden Sie klare Fingernagelpolitur an den vier Ecken des Deckels schlupf, um es zu sichern.

Um das Monoplex zu analysieren, zeigen Sie die Dias auf dem Mikroskop mit einer 250-Millisekunden-Belichtung mit DAPI, um sich zu fokussieren. Bewerten Sie jede Monoplexfolie, indem Sie die Fluoreszenzintensität des gebeizten Markers betrachten und vergleichen Sie diese Intensität mit dem Hintergrund. Verwenden Sie die Folienposition im endgültigen Multiplex, wenn die Farbmarkierungsintensität mindestens fünfmal höher ist als der Hintergrund.

Wenn Sie das Multiplex färben, wählen Sie für jeden Antikörper die passende Reihenfolge und weisen Sie jedes Fluorophor einem Antikörper zu. Fahren Sie mit der Färbung des Multiplexs wie zuvor beschrieben fort und bereiten Sie ein blindes Dia vor, das Antikörperverdünnung, Fluorophorverdünnung und TBST anstelle von Primärantikörpern, Fluorophor oder DAPI erhält. Wenn Sie bereit sind, das Multiplex auf dem Mikroskop abzubilden, stellen Sie die Belichtungszeit für alle Kanäle auf 250 Millisekunden ein, und erfassen Sie jedes Bild mit DAPI, um es zu fokussieren.

Verwenden Sie dann die Analysesoftware, um jeden Multiplex durch fluoreszierende falsche Farbe und pathologieansicht auszuwerten, die die Spezifität jedes Markers bestätigt. Um den Erfolg des Multiplex-Assays zu gewährleisten, muss ein Monoplex-Assay durchgeführt werden, um die Reihenfolge jedes Antikörpers zu bestimmen. Wenn sich Beispielsweise Foxp3 an der dritten Position des Arrays befindet, wird eine spezifische und robuste Färbung und Kolokalisierung mit CD3 demonstriert.

Im Gegensatz dazu tritt bei Foxp3 an erster Stelle eine unspezifische Färbung von Foxp3 auf. Auf den meisten Der Rutsche sind kornige und effuse Bereiche von Rot vorhanden, und die fluoreszierende Intensität dieser Bereiche ist gering. Ein weiterer wichtiger Schritt in diesem Test ist die DEPI-Gegenfärbung, die die Grundlage für die Zellidentifikation und weitere Analyse ist.

Ein deutlicher Kontrast zwischen Bildern mit funktionierender und arbeitsfreiem DAPI ist zu erkennen. Für den Multiplex-Assay spiegeln schöne zusammengesetzte Bilder nicht immer einen genauen Fleck wider. Während CD3 visualisiert ist und eine spezifische Färbung zeigt, beweist die pathologie-Hellfeldansicht von CD163, dass der Antikörper unspezifisch ist.

Ein optimales Multiplexbild zeigt eine spezifische Färbung in einem zusammengesetzten Bild, und die CD3- und CD163-Spezifität wird mit der Pathologie-Hellfeldansicht bestätigt. Im Anschluss an dieses Verfahren können Selbstphänotypisierungs- und räumliche Analyseberechnungen durchgeführt werden, um Zell-zell-Wechselwirkungen weiter zu analysieren. Diese Technik hat den Weg für Forscher geebnet, räumliche Muster von Zellen und intaktem Gewebe zu erforschen, was unser Verständnis der Tumorimmunmikroumgebung fördert.