Thrombozyten-abgeleitete extrazelluläre Vesikelfunktionalisierung von Ti-Implantaten
5. August 2021
Hier stellen wir eine Methode zur Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) vor, die von den Thrombozytenlysaten (PL) abgeleitet sind, und deren Verwendung zur Beschichtung von Titan (Ti) Implantatoberflächen. Wir beschreiben das Drop-Casting-Beschichtungsverfahren, das EVs-Freisetzungsprofil von den Oberflächen und die In-vitro-Biokompatibilität von EVs beschichteten Ti-Oberflächen.
Die Kombination extrazellulärer Vesikel mit Biomaterialien ist ein wünschenswerter Ansatz für Studien zur regenerativen Medizin. So berichtet diese Studie über die Titanfunktionalisierung mit EVs als praktisches Werkzeug für die Orthopädie und Knochenregeneration. Die Tropfengussfunktionalisierung ist eine einfache und kostengünstige Methode im Vergleich zu anderen Strategien wie polymerem Einfangen oder biochemischer Bindung.
Beginnen Sie mit der Funktionalisierung der Titanoberfläche, indem Sie die Titanscheiben mit entionisiertem Wasser in einem Glasbecher waschen. Entsorgen Sie dann das Wasser, bevor Sie die Scheiben mit 70% Ethanol waschen. Dekantieren Sie die Lösung, um die gewaschenen Implantate bei 50 ° C für fünf Minuten in deionisiertem Wasser zu beschallen.
Nach dem Entsorgen des Wassers inkubieren Sie Titanimplantate in einer 40% igen Natriumhydroxidlösung bei 50 ° C für 10 Minuten unter Rühren und beschallen Sie dann die Implantate in deionisiertem Wasser wie gezeigt. Als nächstes führen Sie mindestens fünf Wäschen der Implantate mit deionisiertem Wasser durch. Bis der pH-Wert auf dem pH-Indikator neutral ist.
Wiederholen Sie den Beschallungs- und Inkubationsprozess, wie zuvor erläutert, indem Sie Natriumhydroxid durch 50% Salpetersäure ersetzen. Führen Sie die Wäschen und die Beschallung mit entionisiertem Wasser durch, bevor Sie die Implantate in einer 70% igen Ethanollösung lagern. Inkubieren Sie die Titanimplantate in einer 30%igen Salpetersäurelösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter sanfter Bewegung.
Nach der Inkubation mindestens fünf Wäschen mit entionisiertem Wasser durchführen, bis der pH-Wert bei den pH-Indikatoren neutral ist. Dann Titanimplantate über Nacht bei Raumtemperatur in deionisiertem Wasser inkubieren. Am nächsten Tag trocknen Sie die Implantate unter Vakuum bei 40 ° C für 10 Minuten ab.
Legen Sie unter dem Zellkulturschrank Titanimplantate in eine 96-Well-Platte mit der Maschinenseite nach oben. Ordnen Sie für die extrazellulären Vesikel EVs Drop Casting durch Auftauen von EVs Lösung und Vortexing Lösung bei einem Impuls von drei Sekunden. Nach dem Mischen 40 Mikroliter der EVs-Lösung auf der Titanoberfläche abscheiden, um maximal 4 x 10 ^ 11 EVs pro Implantat zu immobilisieren, entsprechend der Konzentration, die durch Nanopartikel-Tracking-Analyse bestimmt wurde.
Als nächstes stellen Sie die Platten unter Vakuumbedingungen bei 37 ° C für ungefähr zwei Stunden oder bis die Tropfen vollständig trocken sind. Stellen Sie die Trocknungszeit in Abhängigkeit von der Anzahl der Titanimplantate und dem in der Vakuumkammer vorhandenen Wasser ein. Die Menge der aus Titanscheiben freigesetzten EVs wurde durch Nanopartikel-Tracking-Analyse gemessen.
An Tag 2 wurden rund 10^9 EVs freigegeben, gefolgt von einer anhaltenden Freisetzung an den Tagen 6, 10 und 14. Die In-vitro-Zellbiokompatibilität der Titan-EVs wurde mit Laktatdehydrogenase oder LDH-Freisetzungsassay 48 Stunden nach der Zellaussaat auf den Implantaten beurteilt. Titan-EVs zeigten eine geringere Menge an LDH als der maximal akzeptierte zytotoxische Wert.
Während die Titan-Kontrollgruppe höhere LDH-Aktivitätsniveaus zeigte. Der wichtigste Schritt ist die Vakuumtrocknung des beschichteten Implantats. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das gesamte Wasser verdampft wird, um eine optimale Physisorption zu erreichen.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Thrombozytenlysaten und deren Anwendung bei der Beschichtung von Titanimplantatoberflächen vor. Im Mittelpunkt steht die Tropfen-Auftragsmethode (Drop Casting) zur Funktionalisierung, das Freisetzungsprofil der EVs sowie die Biokompatibilität der beschichteten Oberflächen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Regenerativen Medizin
- Orthopädie
- Biomaterialien
Hintergrund
- Extrazelluläre Vesikel sind wichtig für die regenerative Medizin.
- Die Beschichtung von Biomaterialien mit EVs kann deren Funktionalität verbessern.
- Titan wird häufig bei orthopädischen Implantaten verwendet.
- Funktionalisierungsmethoden unterscheiden sich hinsichtlich Komplexität und Kosten.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer praktischen Methode zur Funktionalisierung von Titanoberflächen.
- Beurteilung der Biokompatibilität von EV-beschichteten Titanoberflächen.
- Bereitstellung einer kostengünstigen Alternative zu bestehenden Funktionalisierungstechniken.
Verwendete Methoden
- Isolierung von EVs aus Thrombozytenlysaten.
- Tropfpräzipitationsmethode zur Beschichtung von Titanoberflächen.
- Waschen von Titan-Scheiben mit entionisiertem Wasser und Ethanol.
- Sonikation von Implantaten zur Verbesserung der Oberflächenvorbereitung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von EVs aus Thrombozytenlysaten.
- Effektive Beschichtung von Titanoberflächen mittels der Drop-Casting-Methode.
- Nachgewiesenes Freisetzungsprofil von EVs aus beschichteten Oberflächen.
- Die In-vitro-Biokompatibilität von EV-beschichteten Titanoberflächen wurde bestätigt.
Schlussfolgerungen
- Die Tropfengießmethode ist ein geeigneter Ansatz für die Titanfunktionalisierung.
- Titanoberflächen, die mit EV beschichtet sind, zeigen vielversprechende Eigenschaften für orthopädische Anwendungen.
- Diese Methode bietet eine kostengünstige Alternative für die Funktionalisierung von Biomaterialien.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht eine kostengünstige, skalierbare Funktionalisierung von Titanimplantaten mit thrombozytenabgeleiteten extrazellulären Vesikeln, um das osteogene Potenzial in orthopädischen Anwendungen zu steigern. Durch die Verbesserung der Bioaktivität von Biomaterialien über EV-vermittelte Signalgebung unterstützt sie die Validierung von Zielstrukturen in frühen Stadien bei Strategien zur Knochenregeneration. Der Ansatz bietet eine reproduzierbare Plattform zur Risikominimierung in der präklinischen Entwicklung implantatbasierter regenerativer Therapien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von EV-vermittelten osteogenen Signalwegen auf Biomaterialoberflächen.
- Operativer Wert: Bietet ein standardisiertes, kostengünstiges Verfahren zur Herstellung bioaktiver Implantatoberflächen für die funktionelle Untersuchung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare EV-Freisetzungsmuster, die mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Standardisierung von Assays messbar sind.
- Operativer Wert: Unterstützt die reproduzierbare Oberflächenbeschichtung mittels Tropfenguss, wodurch eine konsistente in-vitro-Bewertung von Verbindungen oder Biomaterialien ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Demonstriert eine anhaltende EV-Freisetzung über 14 Tage, die eine verlängerte bioaktive Signalübertragung in präklinischen Modellen unterstützt.
- Operationaler Wert: Bestätigt die Biokompatibilität mittels LDH-Assay und verringert damit das Risiko einer Zytotoxizität bei der frühen Implantatevaluierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Entdeckungs- bis präklinische Abfolge ein, indem sie die Oberflächenvorbereitung für bioaktive Screening-Verfahren, Assay-Entwicklung und Implantat-Validierung in Pipeline-Prozessen der Knochenregeneration ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von EV-vermittelten osteogenen Mechanismen auf Titan-Substraten.
- Screening: Ermöglicht eine standardisierte, reproduzierbare Beschichtung von Implantaten zur konsistenten Bewertung bioaktiver Verbindungen oder Vesikel.
- Analytik: Liefert quantitative Daten zur EV-Freisetzung mittels Nanopartikel-Tracking und Biokompatibilitätsaussagen über den LDH-Assay.
- Translationale Forschung: Verbindet die funktionelle EV-Modifizierung im Entdeckungsstadium mit der präklinischen Validierung anhand von Daten zur anhaltenden Freisetzung und Biokompatibilität.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare, kostengünstige Plattform zur Funktionalisierung titanbasierter Implantate in mehreren Programmen der regenerativen Medizin.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Target-Vertrauen, indem die EV-vermittelte osteoinduktive Aktivität auf Implantatoberflächen validiert wird.
- Operationaler Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Schritte des Waschens, Sonikationsbehandlung und Vakuumtrocknung.
- Strategischer Wert: Verringert biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien, indem eine frühe Beurteilung der Biokompatibilität und Bioaktivität von Implantaten ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt risikoadjustierte Go/No-Go-Entscheidungen in der Entwicklungspipeline orthopädischer Biomaterialien.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolierung extrazellulärer Vesikel und in der Nanopartikel-Tracking-Analyse.
- Hängt vom Zugang zu Vakuumtrocknungsgeräten und pH-Überwachung für die Oberflächenvorbereitung ab.
- Erfordert die Standardisierung der EV-Konzentration und des Tropfenvolumens über alle Produktionschargen hinweg.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für unterschiedliche Geometrien und Oberflächen von Titanimplantaten.
- Ist durch die Notwendigkeit aseptischer Handhabung während der EV-Abscheidung und Trocknungsschritte begrenzt.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:40
Titanium Discs Wash
1:43
Titinium Passivation and Extracellular Vesicles (EVs) Drop Casting
3:04
Results: Accumulative EV Release of Titanium Functionalized Surfaces and In Vitro Cell Biocompatibility of Titanium-EVs
3:50
Conclusion
