Verwendung von Crystal Violet zur Verbesserung des visuellen zytopathischen Effekt-basierten Lesens für die virale Titration mit TCID50-Assays
12. Februar 2022
Dieses Protokoll zeigt einen genauen und objektiven Ansatz zur Visualisierung viraler Titrationen unter Verwendung von Kristallviolett, indem es mit optischer Mikroskopie und immunzytochemischer Färbung verglichen wird.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Virusbestandstitration zu erzeugen und sie durch Kristallviolettfärbung zu visualisieren. Dazu wird eine allgemeine virale Titration demonstriert, gefolgt von der Färbung. Diese Titration wird in einer 96-Well-Platte für einen Zeitraum von sieben Tagen in einer Biosicherheitswerkbank innerhalb eines Labors der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt.
Dazu wird eine 96-Well-Platte der bevorzugten Zelllinie unter Verwendung des entsprechenden Mediums ausgesät und bis zum Zusammenfluss wachsen lassen. Der Virusbestand wird mit zehnfachen Verdünnungen verdünnt, indem 900 Mikroliter Medien und 100 Mikroliter Virus oder die entsprechende Verdünnung gemischt werden. Stellen Sie sicher, dass Sie jedes Röhrchen wirbeln, um eine ordnungsgemäße Vermischung des Mediums und des Virus zu gewährleisten und Fehler bei den Verdünnungen zu vermeiden.
Schreiben Sie das Layout Ihrer Platte in den Lead sowie jede Verdünnung, um während des Infektionsprozesses zu helfen. Vor der Infektion mit 200 Mikrolitern PBS waschen. Fügen Sie 50 Mikroliter Ihres Inokulums in die entsprechenden Vertiefungen hinzu.
Dann sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren. Nach der siebentägigen Inkubation mit 200 Mikrolitern PBS waschen. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 50 Mikroliter pro Vertiefung PFA bei 4% in PBS hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Nach der Inkubation die Zellen zweimal mit 200 Mikrolitern PBS waschen, bevor 50 Mikroliter pro Vertiefung Kristallviolett in Wasser zugegeben werden, und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zum Schluss Kristallviolett aus den Vertiefungen absaugen und optional die Platten zwei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen lassen oder mit 200 Mikrolitern Wasser waschen, um übermäßige Flecken vor der Visualisierung zu entfernen. Infolgedessen werden nach der erneuten Färbung negative Zellen gefärbt.
Positive Brunnen werden gerodet. Diese Informationen werden in einer der beiden beschriebenen Formeln verwendet, um Ihren endgültigen Virustiter zu berechnen. Wenn der mit jeder Methode erhaltene Titer verglichen wurde, zeigte sich, dass in der Monozytochemie die Färbung in einigen Fällen zusätzliche positive Vertiefungen im Vergleich zu Kristallviolett erkennen konnte, und dass beide Färbemethoden auch mehr positive Vertiefungen erkennen konnten als die visuelle Bewertung durch Mikroskopie.
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Übersicht
Dieses Protokoll demonstriert eine genaue Methode zur Visualisierung von Virus-Titrationen mithilfe der Kristallviolett-Färbung. Es vergleicht diese Methode mit der optischen Mikroskopie und der immunzytochemischen Färbung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Virologie
- Zellbiologie
- Laborverfahren
Hintergrund
- Die Virus-Titration ist entscheidend zur Quantifizierung von Virus-Stämmen.
- Die Kristallviolett-Färbung liefert eine visuelle Darstellung des Vorhandenseins von Viren.
- Zu den vergleichenden Methoden gehören die optische Mikroskopie und die immunzytochemische Färbung.
- Die korrekte Verdünnungstechnik ist entscheidend für genaue Ergebnisse.
Zweck der Studie
- Herstellung einer Virusstammverdünnungsreihe.
- Visualisierung der Verdünnungsreihe mittels Kristallviolett-Färbung.
- Gewährleistung der Genauigkeit bei Methoden zur Virusquantifizierung.
Verwendete Methoden
- Ansäen einer bevorzugten Zelllinie in einer 96-Well-Platte.
- Durchführung von Verdünnungen der Virusstammlösung um den Faktor zehn.
- Vortexen jeder Verdünnung zur ordnungsgemäßen Durchmischung.
- Färbung mit Kristallviolett nach einer siebentägigen Inkubationszeit.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von Virustitrationen mittels Kristallviolett.
- Der Vergleich mit anderen Färbemethoden zeigte Konsistenz.
- Präzise Quantifizierung von Virusbeständen erreicht.
- Das Protokoll stellt eine zuverlässige Methode für zukünftige Studien dar.
Schlussfolgerungen
- Die Kristallviolett-Färbung ist eine effektive Methode zur Visualisierung von Virus-Titrationen.
- Das Protokoll verbessert die Genauigkeit der Virusquantifizierung.
- Weitere Studien können auf dieser Methode für verschiedene Anwendungen aufbauen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine genaue virale Titrierung ist entscheidend für die antivirale Wirkstoffscreening und die Impfstoffentwicklung, da inkonsistente Nachweise des zytopathischen Effekts (CPE) die Identifizierung von Leitverbindungen sowie Go/No-Go-Entscheidungen beeinträchtigen können. Die Färbung mit Kristallviolett bietet eine kostengünstige und reproduzierbare Alternative zur immunzytochemischen Färbung, verbessert die Standardisierung des Assays und verringert die Variabilität in frühen Entdeckungsprozessen. Dies erhöht die Vorhersagegenauigkeit bei der Bewertung der antiviralen Wirksamkeit und ermöglicht eine skalierbare, hochdurchsatzfähige, auf dem TCID50-Verfahren basierende Screening-Methode für CPE-bildende Viren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die objektive Quantifizierung der viralen Infektiosität, verringert die Abhängigkeit von subjektiver Mikroskopie und unterstützt die mechanistische Entschärfung antiviraler Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Bietet ein schnelles, kostengünstiges Färbungsverfahren, das den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit von Assays bei der Validierung antiviraler Treffer erhöht.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt klare, quantifizierbare Endpunkte für TCID50-Assays und verbessert dabei das Signal-Rausch-Verhältnis in Screening-Kampagnen für Wirkstoffe.
- Operativer Wert: Beseitigt die Notwendigkeit teurer ICC-Reagenzien, senkt die Kosten pro Assay und ermöglicht eine breitere Anwendung über verschiedene Plattformen der antiviralen Wirkstoffentwicklung hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht konsistente Bestimmungen der viralen Titer über verschiedene Studien hinweg und unterstützt zuverlässige Dosis-Wirkungs-Modellierungen in präklinischen Wirksamkeitsstudien.
- Operativer Wert: Erleichtert die Standardisierung der Virenstammpreparation zwischen verschiedenen Laboren und verringert die Variabilität zwischen Experimenten in zulassungsrelevanten Studien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Kontinuum der antiviralen Wirkstoffentdeckung von der frühen Bestätigung von Hits bis hin zur Optimierung von Leitverbindungen ein, wobei eine genaue Virustitration die Struktur-Wirkungs-Beziehungen und das Resistenzprofil beeinflusst.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem reproduzierbare Virusinfektionsmodelle für Wirkmechanismus-Studien bereitgestellt werden.
- Screening: Liefert standardisierte, quantifizierbare Ergebnisse, die für die Überführung von Hits in Leitstrukturen in antiviralen Screening-Kaskaden unerlässlich sind.
- Analytik: Ermöglicht die präzise Berechnung von TCID50-Werten und damit einen genauen Vergleich der Wirkstoffpotenz unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Stellt durch konsistente Quantifizierung von Virusstämmen die Kontinuität von in-vitro-Antiviralscreenings zu in-vivo-Challengemodellen sicher.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine skalierbare, kostengünstige Methode dar, die auf mehrere virale Zielstrukturen und therapeutische Bereiche anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit hinsichtlich der antiviralen Wirksamkeit, indem falsch-negative Ergebnisse durch visuelle Beurteilung des zytopathischen Effekts reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von TCID50-Assays durch vereinfachte, standardisierte Färbung.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz in antiviralen Programmen, indem die Assay-Kosten gesenkt werden, ohne die Datenqualität zu beeinträchtigen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem zuverlässige Virus-Titer-Daten für Go/No-Go-Kriterien bereitgestellt werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert grundlegende virologische Kenntnisse und aseptische Techniken für den sicheren Umgang mit Viren in BSL-2-Umgebungen.
- Basiert auf Standard-Laborgeräten wie Inkubatoren, Zentrifugen und Plattenlesegeräten zur optionalen Quantifizierung.
- Setzt eine Absprache zwischen Teams bezüglich der Färbedauer und der Waschprotokolle voraus, um die Reproduzierbarkeit zwischen Laboren sicherzustellen.
- Anwendbar auf adhärente Zelllinien, die die Bildung zytopathischer Effekte unterstützen; bei nicht-adhärenten Zellen oder Viren, die keinen zytopathischen Effekt hervorrufen, kann eine Optimierung erforderlich sein.
- Auf Viren beschränkt, die einen nachweisbaren zytopathischen Effekt auslösen; ohne Modifikation nicht geeignet für nicht-zytopathische oder persistierende Infektionsmodelle.
