Standardisierte Identifizierung der Substanzstruktur in der tibetischen Medizin mittels Ionenfallen-Massenspektrometrie und mehrstufiger Fragmentierungsanalyse

Diese Methode kann Forschern helfen, die Strukturen tibetischer Medizinverbindungen, insbesondere der Bestandteile des Baumes, zu analysieren. Es kann einen Einblick in die qualitative Untersuchung des Gehalts an Verbindungen in der Naturmedizin geben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Genauigkeit der in diesem Fall erhaltenen Verbindungsstruktur höher ist als die der Datenbank.

Diese Technik kann bei der Strukturanalyse von Stoffwechselzwischenprodukten in Blase oder Urin eingesetzt werden. Zu Beginn die Samenprobenvorbereitung der tibetischen Medizin Abelmoschus manihot. Wiegen Sie ein Gramm AMS genau ab und geben Sie es in einen Erlenmeyerkolben mit 30 Millilitern 80%igem Methanol.

Mit einem Ultraschall-Bad-Ultraschallgerät bei 40 Kilohertz wird das Gemisch 30 Minuten lang bei 25 Grad Celsius extrahiert. Dann zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 14.000 g. Bereiten Sie eine Injektionsspritze und einen mikroporösen organischen 0,22-Mikron-Membranfilter vor und filtrieren Sie den Überstand in eine Zwei-Milliliter-Probenflasche.

Öffnen Sie nach dem Einschalten des Schalters der Vakuumpumpe das Hauptventil des Argonzylinders zusammen mit dem Partialdruckventil und stellen Sie den Druck auf ca. 0,3 Megapascal ein. Öffnen Sie dann das Stickstoffventil. Starten Sie die Massenspektrometrie-Steuerungssoftware (MS).

Klicken Sie im Software-Panel auf Beheizte ESI-Quelle und stellen Sie die MS-Parameter ein, einschließlich Heiztemperatur, Gasdurchflussraten, Sprühspannung für positive und negative Modi und Kapillartemperatur. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anwenden, um die Ionenquelle für die Flüssigkeitschromatographie oder LC zu aktivieren.Bereiten Sie die mobilen Phasen A und B mit 0,1%iger Ameisensäure in einer wässrigen Lösung in reinem Acetonitril vor. Entgasen Sie sie mindestens 15 Minuten lang in einem Ultraschallbad-Ultraschallgerät mit 40 Kilohertz, bevor Sie die Lösungen an die Flüssigkeitskanäle A bzw. B anschließen.

Bereiten Sie eine Methanol-Wasserlösung im Verhältnis 1:9 vor und füllen Sie sie dann manuell in die Reinigungsflüssigkeitsflaschen der Pumpe und des Injektors. Klicken Sie nach dem Start der LC-MS-Steuerungssoftware auf Direct Control, um das LC-Bedienfeld zu öffnen. Öffnen Sie das Spülventil gegen den Uhrzeigersinn am Pumpenmodul.

Klicken Sie auf Mehr Option, um die Pumpeneinstellung zu öffnen und die Spülparameter drei Minuten lang auf fünf Milliliter pro Minute einzustellen. Klicken Sie auf Bereinigen, um die Entfernung der Blase zu starten. Wenn Sie fertig sind, schließen Sie das Spülventil.

Klicken Sie dann auf Spritze grundieren, um die Spritze drei Zyklen lang zu spülen, auf Pufferschleife waschen, um die Schleife für einen Zyklus zu spülen, und auf Nadel extern waschen, um die Nadel für einen Zyklus zu waschen. Stellen Sie die Probenflasche in den Probenehmer. Klicken Sie auf Geräte-Setup, um das Fenster zur Methodenbearbeitung zu öffnen, und klicken Sie auf Neu, um eine neue LC-MS-Gerätemethode zu erstellen.

Legen Sie eine Gesamtlaufzeit für die Methode fest und legen Sie die Druckgrenze fest. Gesamtdurchflussrate, Durchflussgradient, Probentemperatur, Säulentemperatur und Bereitschaftstemperaturdelta im Methodenbearbeitungsfenster. Wählen Sie für die MS-Methode den Experimenttyp Allgemeines MS oder MSn aus.

Geben Sie Werte für die Erfassungszeit, die Polarität, den Massenbereich, die Anzahl der Umlenkwerte und die Dauer ein. Klicken Sie auf Speichern, um die Einstellungen als Gerätemethode zu konfigurieren. Klicken Sie auf Sequenzeinrichtung, um die Sequenztabelle zu öffnen, in der Sie die Informationen zu Probentyp, Datei, Name, Pfad, Proben-ID, Gerätemethode, Position und Injektionsvolumen eingeben.

Zeichnen Sie die Sequenztabelle auf, indem Sie auf Speichern klicken, implementieren Sie dann die Einstellungen und starten Sie die MS-Erfassung. Um die MS-Daten in die Datenverarbeitungssoftware zu laden, doppelklicken Sie im Explorer auf die Rohdatei. Wählen Sie im Basis-Peak-Chromatogramm BPI die maximale Fläche unter der Kurve oder AUC aus, indem Sie mit der Maus klicken und ziehen.

Das entsprechende MS-Spektrum wird im selben Fenster angezeigt. Wählen Sie ein Zielion für die nächste MS/MS-Analyse aus. Öffnen Sie das Fenster zum Bearbeiten der Methode erneut, und legen Sie in der MSn-Einstellungstabelle das m/z des Zielions auf eine Dezimalstelle in der Spalte Übergeordnete Masse fest.

Wählen Sie als Nächstes den Kollisionsmodus und geben Sie die Kollisionsenergie oder den CE-Wert ein. Stellen Sie den MS/MS-Scanbereich ein. Klicken Sie auf Speichern, um die MS-Methode aufzuzeichnen und einen neuen Dateinamen in die Sequenztabelle einzugeben.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die MS/MS-Erfassung zu starten. Sobald die Erfassung abgeschlossen ist, doppelklicken Sie im Explorer auf die Rohdatei, um die MS/MS-Rohdatei in die Datenverarbeitungssoftware zu laden. Identifizieren Sie das stärkste Fragmention im Spektrum und geben Sie seinen m/z-Wert in die MSn-Methodenliste ein.

Legen Sie in der MSn-Einstellungstabelle die MS3-Parameter fest, einschließlich Kollisionsmodus, CE-Wert und Scanbereich. Klicken Sie erneut auf Speichern, um die MS-Methode aufzuzeichnen und einen neuen Dateinamen in die Sequenztabelle einzugeben. Klicken Sie auf Start, um die MS3-Erfassung zu starten.

Wie bereits gezeigt, doppelklicken Sie im Explorer auf die Rohdatei, um die MS3-Rohdatei in die Datenverarbeitungssoftware zu laden, und wiederholen Sie die Schritte, um das MS4-Spektrum zu erhalten. Um die Daten zu analysieren, doppelklicken Sie auf die Rohdateien, um alle Massenspektren von MS bis MSn zu öffnen. Berechnen Sie manuell die m/z-Differenzwerte zwischen dem Ion und den entsprechenden Fragmentionen.

Zeichnen Sie dann manuell die Kernstruktur gemäß den MS4-Ergebnissen und leiten Sie die ursprüngliche Struktur mithilfe von funktionellen Gruppen oder Molekülsegmenten basierend auf dem m/z-Differenzwert ab. Zeichnen Sie die molekularen Spaltungspfade entsprechend jeder Molekülstruktur in MSn manuell. Die ESI-MS der Modell-Kohlenhydrat-Cellobiose produzierte das proteinatisierte Molekül M H bei m/z 365 im positiven Modus.

Der Produktionenscan oder CID MS/MS ergab ein zweites Fragmention bei m/z 305. Darüber hinaus ergab die MS3- und MS4-Analyse nacheinander das dritte und vierte Fragmention bei m/z 254 bzw. m/z 185. Die MS/MS-Analyse zeigte die Abfolge der Ionenfragmentierungen, nämlich Ringöffnungshydrolyse, CC-Spaltung und Dehydratisierung.

Diese Methode wurde also für Kohlenhydrate als geeignet befunden. Die vorläufige qualitative Analyse von AMS mittels LC Q-TOF MS ergab das Vorhandensein zahlreicher unbekannter Verbindungen. Die negative MSn-Analyse des M-H-Ions bei m/z 617 ergab ein zweites Fragmention bei m/z 571.

Die MS3-Analyse dieses Fragmentions ergab ein drittes Fragmention bei m/z 525 durch den Verlust von Hydroxyethyl als Methanol entsprechend 32 Dalton und Hydroxyl als Wasser, was 18 Dalton entspricht. Die MS4-Analyse ergab vierte Fragmentionen bei m/z 344 und 273. Die manuelle Identifizierung der Kernstruktur ergab die molekulare Struktur der Verbindung bei m/z 617 und ihre Spaltwege in MSn.

Der Produktionenscan des M H-Ions einer anderen unbekannten Verbindung wurde durchgeführt, und seine molekulare Struktur und sein Spaltmechanismus wurden ebenfalls aufgedeckt. Warten Sie nach dem Einschalten der Vakuumpumpe mindestens fünf Stunden, um einen ausreichenden Vakuumgrad für die Versuchsbedingungen sicherzustellen. Die statistische Analyse kann verwendet werden, um die Fragmente mit dem gleichen oder einem ähnlichen Masse-zu-Ladungs-Verhältnis zusammenzustellen.

Mit der zunehmenden Verbreitung von Massenspektrometrielösungen könnte diese Technik Forschern helfen, neuere Verbindungen in Naturheilmitteln zu gewinnen.