Schnelle In-vitro-Zytotoxizitätsbewertung des Jurkat-exprimierenden chimären Antigenrezeptors mittels Fluoreszenzbildgebung
27. Oktober 2023
Ein Protokoll zur Bewertung der quantitativen Abtötung von Tumorzellen durch Jurkat-Zellen, die chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren, der auf ein einzelnes Tumorantigen abzielt. Dieses Protokoll kann als Screening-Plattform für die schnelle Optimierung von CAR-Scharnierkonstrukten vor der Bestätigung in aus dem peripheren Blut gewonnenen T-Zellen verwendet werden.
CAR-T-Zellen werden ständig verbessert, um in klinischen Studien am Menschen ein besseres Ansprechen zu erzielen. Wir suchen nach Möglichkeiten, dies in unserem Labor mit einer unvoreingenommenen Hochdurchsatzmethode zu bewerten, z. B. durch die Verwendung von Fluoreszenzbildgebung, um Kombinationen zu screenen, die am besten funktionieren. Es gibt mehrere Kombinationen von Konstrukten, die für jedes einzelne variable Fragment einer Kette entworfen werden können, indem die Geometrie der extrazellulären und Scharnierdomänen geändert wird.
Wir haben dieses Protokoll entwickelt, um die Kombinationen mit der besten Wirksamkeit bei der Eliminierung von Zielzellen mit Jurkat-Zellen zu identifizieren. Dabei handelt es sich um ein schnelles Hochdurchsatzprotokoll zum Screening von CAR-Konstrukten auf der Grundlage ihrer Zytotoxizität in Zielzellen unter Verwendung von Jurkat-Zellen, die dann mit herkömmlichen T-Zellen validiert werden. Mit dieser Technik können ein Dutzend verschiedener CAR-Konstrukte gleichzeitig in einer 96-Well-Platte getestet werden.
Hier im Akhavan Lab quantifizieren wir in absoluten Zahlen die direkte Zyklose von Zielzellen, indem die CAR-exprimierenden Jurkat-Zellen im Hochdurchsatz mehrere CAR-Konstrukte screenen. Das primäre Ziel unseres Labors ist es, die klinische Translation der CAR-T-Zell-Therapie gegen hochgradige Hirntumoren zu verbessern. Wir nutzen Hochdurchsatz-Wirkstoffscreenings als eine Modalität, um die Zytotoxizität von CAR-T-Zellen zu verbessern und auf die Mikroumgebung des Tumors abzuzielen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Hochdurchsatzmethode zur Beurteilung der Zytotoxizität von CAR-exprimierenden Jurkat-Zellen gegenüber Tumorzellen. Es ermöglicht eine schnelle Untersuchung verschiedener CAR-Konstrukte, um die effektivsten Kombinationen zur gezielten Bekämpfung spezifischer Tumorantigene zu identifizieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Krebsebiologie
- Zelluläre Therapie
Hintergrund
- CAR-T-Zellen werden weiterentwickelt, um die klinischen Ergebnisse zu verbessern.
- Hochdurchsatz-Screening-Methoden sind entscheidend zur Optimierung von CAR-Konstrukten.
- Jurkat-Zellen dienen als Modell zur Beurteilung der Wirksamkeit von CARs.
- Diese Studie konzentriert sich auf die Zytotoxizität von CAR-Konstrukten gegenüber Zielzellen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur effizienten Untersuchung von CAR-Konstrukten.
- Quantifizierung der zytotoxischen Wirkung von CAR-exprimierenden Jurkat-Zellen.
- Identifizierung optimaler CAR-Konfigurationen zur gezielten Ansteuerung von Tumormarkern.
Verwendete Methoden
- Fluoreszenzbildgebung für das Hochdurchsatz-Screening.
- Beurteilung mehrerer CAR-Konstrukte im 96-Loch-Plattenformat.
- Quantifizierung der Zielzellabtötung durch CAR-exprimierende Jurkat-Zellen.
- Vergleich mit konventionellen T-Zell-Antworten zur Validierung.
Hauptergebnisse
- Identifizierung wirksamer CAR-Konstrukte für die Tumorzellabtötung.
- Nachweis von Hochdurchsatzfähigkeiten unter Verwendung von Jurkat-Zellen.
- Quantitative Bewertung der Zytotoxizität verschiedener Konstrukte.
- Potenzial zur schnellen Optimierung von CAR-Designs vor der klinischen Anwendung.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht eine effiziente Untersuchung von CAR-Konstrukten.
- Jurkat-Zellen stellen ein zuverlässiges Modell zur Beurteilung der Wirksamkeit von CARs dar.
- Dieser Ansatz kann die Entwicklung von CAR-T-Zell-Therapien beschleunigen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die schnelle, hochdurchsatzfähige Bewertung der Zytotoxizität von CAR-Konstrukten in Jurkat-Zellen ermöglicht eine frühzeitige Risikominderung und Priorisierung von CAR-Designs, bevor aufwändige Validierungen in primären T-Zellen erfolgen. Diese Plattform beschleunigt die Identifizierung von CARs mit optimierter Scharnierregion und überlegener Zielzellabtötung und unterstützt so eine effiziente Selektion im Portfolio von Onkologie-Zelltherapie-Pipelines. Durch die Quantifizierung der Zytotoxizität über mehrere Konstrukte hinweg können Teams datengestützte Entscheidungen an entscheidenden Wendepunkten der Entdeckungsforschung treffen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine schnelle Untersuchung von CAR-Konstruktpermutationen zur funktionellen Target-Validierung.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch Quantifizierung der direkten Zytotoxizität in einem kontrollierten System.
- Erleichtert eine vorhersagebasierte Zuversicht bei der Konstruktauswahl vor der Engineering von primären T-Zellen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte CAR-Jurkat-Systeme für nachgeschaltete Hochdurchsatz-Screening-Workflows vor.
- Standardisiert Zytotoxizitätsassays mit quantitativen fluoreszenzbasierten Bildgebungsdaten.
- Ermöglicht die reproduzierbare und skalierbare parallele Evaluierung mehrerer CAR-Konstrukte.
- Ermöglicht die zuverlässige Evaluierung von Verbindungen oder Konstrukten in 96-Well-Plattenformaten.
Translationale und präklinische Forschung
- Verknüpft frühe Zytotoxizitätsdaten mit translationsbezogenen Zielen, indem Befunde in aus PBMCs stammenden T-Zellen bestätigt werden.
- Gewährleistet Kontinuität von der konstruktbezogenen Optimierung im Entdeckungsstadium bis hin zu präklinischen Validierungsschritten.
- Verringert das Risiko einer Ausscheidung in späteren Stadien, indem suboptimale CAR-Konstrukte bereits frühzeitig ausgesondert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Hochdurchsatz-Plattform für zelltoxische Untersuchungen befindet sich im Übergangsbereich zwischen früher Entdeckung und Identifizierung von Leitverbindungen und verbindet die Konstruktgestaltung mit der präklinischen Validierung. Sie ermöglicht eine schnelle Hypothesenprüfung und Vorauswahl von Konstrukten, bevor diese zu aufwändigen Studien mit primären T-Zellen oder in vivo-Analysen weiterentwickelt werden.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die hypothesengeleitete Bewertung von Modifikationen der Scharnier- und extrazellulären Domäne hinsichtlich der Wirksamkeit von CARs.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare Zytotoxizitätsdaten für den Vergleich und die Rangfolge von Konstrukten.
- Analytik: Bietet absolute Zellzahlen und statistische Auswertungen (z. B. einfaktorielle ANOVA), um Entscheidungsprozesse zu unterstützen.
- Translationale Forschung: Bestätigt die Leistungsfähigkeit der Konstrukte in aus PBMCs stammenden T-Zellen und unterstützt damit die translationale Kontinuität.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine skalierbare und wiederverwendbare Plattform für laufende Optimierungskampagnen von CAR-Konstrukten.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Auswahl von CAR-Konstrukten.
- Operationaler Wert: Standardisiert und skaliert die Beurteilung der Zytotoxizität und ermöglicht eine effiziente Ressourcenallokation.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch sowie die Kapitalnutzungseffizienz, indem Konstrukte frühzeitig aussortiert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von CAR-Kandidaten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Konstruktion von CAR-Vektoren und der lentiviralen Transduktion von Jurkat-Zellen.
- Benötigt Zugang zu fluoreszenzbildgebenden Geräten und analytischer Software für quantitative Auswertungen.
- Erfordert eine standardisierte Durchführung des Assays und der Parameter der Datenanalyse über Teamgrenzen hinweg.
- Die Anpassung an andere Zellmodelle oder Antigene kann eine Optimierung des Protokolls erfordern.
- Hängt von einer robusten statistischen Analyse (z. B. ANOVA) für den Vergleich der Konstrukte ab.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
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