Quantifizierung der NK-Zell-Zytotoxizität, verstärkt durch chimerische Antigenrezeptoren und therapeutische Antikörper mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie

Unser Labor untersucht die Rolle natürlicher Killerzellen in Gesundheit und Krankheit, mit dem Ziel, ihr Potenzial zur Verbesserung von Therapien bei soliden Tumoren und Blutkrebserkrankungen zu nutzen. Bestehende NK-Zell-Zytotoxizitätsassays weisen across Plattformen und Versuchsaufbauten einen Mangel an Standardisierung auf. Dieses Protokoll stellt reproduzierbare Methoden zur Live-Cell-Imaging- und Durchflusszytometrie bereit, um eine genaue Beurteilung der Zytotoxizität zu ermöglichen.

Bereiten Sie zunächst 10 Milliliter 2x SYTOX Orange vor, indem Sie die SYTOX Orange-Stammlösung in NK-92-Kulturmedium in einem 15-Milliliter-Kegelrohr pipettieren. Zählen Sie die Zielzellen mithilfe eines Luna Counters nach Zugabe von Trypanblau oder mit einer anderen validierten Zellzählmethode basierend auf Farbausschluss. Überführen Sie die benötigte Menge an Zielzellen in ein 15-Milliliter-Kegelrohr.

Zentrifugieren Sie das Gefäß bei 300 × g fünf Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand. Suspendieren Sie die Zielzellen anschließend erneut in 2X SYTOX Orange-Medium, um eine Endkonzentration von 250.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen. Zur Vorbereitung der Effektorzellen bewerten Sie die Vitalität und Konzentration der NK-92-Zellen und fahren Sie nur fort, wenn die Vitalität über 80 % liegt, da eine geringere Vitalität die Leistung des Assays beeinträchtigen könnte.

Zählen und übertragen Sie die erforderliche Anzahl NK-92-Zellen in einzelne kegelförmige Zentrifugenröhrchen mit einem Volumen von 15 Milliliter. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in einem Endvolumen von 500.000 Zellen pro Milliliter. Bereiten Sie Verdünnungen der Effektorzellen vor, indem Sie 240 Mikroliter Effektorzellen in die Vertiefungen einer 96-Loch-Rundbodenplatte für ein Verhältnis von zwei Effektorzellen zu einer Zielzelle geben und 120 Mikroliter Medium zu den verbleibenden Vertiefungen hinzufügen.

Führen Sie Verdünnungsreihen mit Verdünnungsfaktor zwei von zwei zu eins bis 0,25 zu eins an Effektor- zu Zielzellen-Verhältnissen durch, wobei gründlich durch mindestens fünfmaliges Pipettieren gemischt wird und zwischen den Übertragungen die Spitzen gewechselt werden. Danach bereiten Sie die Ko-Kultur vor, indem Sie eine mit Polylysin beschichtete 96-Loch-Platte mit flachem Boden bereitstellen. Unmittelbar vor der Übertragung suspendieren Sie die Ziel- und Effektorzellen gründlich, ohne Blasen zu bilden, und geben anschließend jeweils 100 µL der Zellsuspension in die entsprechenden Löcher.

Anschießend 200 Mikroliter PBS in die umliegenden unbenutzten Vertiefungen geben. Die Platte zwei Minuten bei Raumtemperatur mit 100 × g zentrifugieren. Die Platte in das Live-Cell-Imaging-System stellen.

Nehmen Sie alle eine Stunde über einen Zeitraum von 24 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid Bilder auf. Überprüfen Sie nach dem ersten Scan die Bildqualität und passen Sie gegebenenfalls die Aufnahmeeinstellungen an. Passen Sie die spektrale Entmischung an, um die Übersprechen von SYTOX Orange in den grünen Kanal zu korrigieren.

Überprüfen Sie, dass orange positive tote Zellen nicht fälschlicherweise als grün positive Zellen identifiziert werden. Um die Analyse einzelner nicht-ankernder Zellen einzurichten, stellen Sie den erwarteten Objektdurchmesser auf 15 Mikrometer ein, um dem ungefähren Zelldurchmesser zu entsprechen. Stellen Sie die Schwellwertempfindlichkeit und Texturempfindlichkeit auf fünf und die Kantenempfindlichkeit auf 10 ein, um die Trennung von Zellclustern zu erleichtern.

Stellen Sie den Bereichsfilter für akzeptierte Objekte auf 50 bis 2.000 Quadratmikrometer ein, um Schmutzpartikel und große Objekte auszuschließen. Legen Sie die maximale Exzentrizität auf 0,95 fest, um nicht-zelluläre Objekte auszuschließen. Beschaffen Sie primäre humane NK-Zellen, die 16 bis 24 Stunden lang kultiviert wurden.

Überführen Sie 500.000 Zielzellen in ein kegelförmiges Zentrifugenröhrchen mit 15 Milliliter Fassungsvermögen. Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 300G.

Entfernen Sie dann den Überstand. Bereiten Sie eine 0,5 Mikromolare Arbeitslösung von Carboxyfluorescein-Succinimidylester oder CFSC in PBS zu, indem Sie ein Mikroliter der fünf Millimolaren CFSE-Stammlösung in 10 Milliliter PBS verdünnen. Resuspendieren Sie das erhaltene Pellet in der CFSE-Lösung bei etwa einer Million Zellen pro Milliliter.

Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, in Aluminiumfolie gewickelt, um sie vor Licht zu schützen. Danach stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von fünf bis zehn Volumina Kulturmedium und inkubieren fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation der Zellen resuspendieren Sie das Zellpellet bei 250.000 Zellen pro Milliliter, sodass 100 Mikroliter 25.000 Zellen enthalten.

Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette je 100 Mikroliter Zielzellen pro Vertiefung in die vorgesehenen Vertiefungen einer runden 96-Loch-Platte. Pflanzen Sie jede Bedingung im Dreifachansatz aus. Bereiten Sie anschließend für jeden Testantikörper und den dazugehörigen Isotyp-Kontrollantikörper jeweils 200 Mikroliter einer 4fach konzentrierten Antikörperlösung in NK-Zellkulturmedium vor.

Überführen Sie die Antikörperlösungen in eine Tieflochplatte. Geben Sie 50 Mikroliter Antikörperlösung in jedes Loch, das die Zielzellen enthält, und mischen Sie gründlich durch mindestens fünfmaliges Auf- und Abpipettieren. Geben Sie 50 Mikroliter NK-Zellkulturmedium pro Loch zu den Kontrolllöchern ohne Antikörper hinzu und mischen Sie gründlich durch Pipettieren.

Die Platte 25 bis 30 Minuten unter standardmäßigen Inkubationsbedingungen inkubieren. NK-Zellen zählen und 200.000 Zellen gewinnen, und nur fortfahren, wenn die Vitalität größer oder gleich 75 % ist. Die Zellen in 800 Mikrolitern primärem humanen NK-Zellkulturmedium auf eine Dichte von 250.000 Zellen pro Milliliter resuspendieren. Jeweils 50 Mikroliter der NK-Zellsuspension pro Vertiefung in die entsprechenden Vertiefungen geben und mindestens fünfmal auf- und abpipettieren, um gründlich zu mischen.

Pipettieren Sie anschließend 50 Mikroliter Kulturmedium pro Vertiefung in die Kontrollvertiefungen und mischen Sie gründlich. Überprüfen Sie sorgfältig die Rundboden-96-Well-Platte, um sicherzustellen, dass alle Vertiefungen 200 Mikroliter mit einheitlichem Meniskus und ohne Blasen enthalten. Zentrifugieren Sie die Platte zwei Minuten bei 100 × g und inkubieren Sie sie anschließend 16 bis 18 Stunden unter standardmäßigen Inkubationsbedingungen.

Zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten bei 300 × g und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie alle Vertiefungen mit je 200 µL Fluoreszenz-Aktiviert-Zellsortier- oder FACS-Puffer. Bereiten Sie eine Master-Mischung für Oberflächenantikörper im FACS-Puffer wie hier dargestellt vor.

Suspendieren Sie die Zellen erneut in 50 Mikroliter pro Vertiefung Antikörper-Mastermix und mischen Sie gründlich durch mindestens fünfmaliges Auf- und Abpipettieren. Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten bei vier Grad Celsius, in Aluminiumfolie eingewickelt, um Lichteinfluss zu vermeiden. Geben Sie 150 Mikroliter pro Vertiefung FACS-Puffer hinzu.

Nach der Zentrifugation die Zellen in 100 Mikroliter pro Mulde fünf Mikromolar DAPI in FACS-Puffer resuspendieren. Unverzüglich zur Durchflusszytometrie-Aufnahme übergehen, ohne vorherige Inkubation vor der Aufnahme. Die Durchflusszytometrie mit dem Cytek Aurora-Gerät durchführen und die Fluoreszenzkanäle für CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI sowie alle weiteren Fluorophore aufzeichnen.

Während der Kokultur wurden Effektorzellen, lebende Zielzellen und tote Zellen mittels Echtzeit-Lebendzellmikroskopie visualisiert. Die CAR2- und CAR3-NK-92-Zellen zeigten eine schnellere Abtötungskinetik als die CAR1-NK-92-Zellen, insbesondere zu früheren Zeitpunkten bei einem gleichen Effektor-zu-Ziel-Zell-Verhältnis. Die Abtötung der Zielzellen nahm mit höheren Effektor-zu-Ziel-Verhältnissen zu, einschließlich der Kontroll-NK-92-Zellen, die eine natürliche Zytotoxizität aufwiesen.

CAR2- und CAR3-NK-92-Zellen zeigten bei niedrigeren Effektor-zu-Target-Verhältnissen zu späteren Zeitpunkten eine höhere Wirksamkeit. Während zu früheren Zeitpunkten eine erhöhte Wirksamkeit bei intermediären Effektor-zu-Target-Verhältnissen beobachtet wurde. Zur Quantifizierung der Wirksamkeit, Abtötungskinetik und gesamten zytotoxischen Leistungsfähigkeit von CAR-NK-92-Zellen über verschiedene Effektorpopulationen hinweg wurden drei Parameter definiert: KR50, KT50 und IKI-50.

Die Zugabe von Daratumumab allein verringerte die Überlebensfähigkeit der Zielzellen nicht, was bestätigt, dass der Antikörper ohne Effektorzellen keine direkte Wirkung auf die Vitalität der Zielzellen hatte. Die Kokultur mit NK-Zellen allein reduzierte die Überlebensfähigkeit der Zielzellen auf etwa 70 %, was auf eine basale natürliche Zytotoxizität hinweist. Die Zugabe von Daratumumab verringerte die Zellüberlebensfähigkeit weiter auf etwa 37 %, was mit einer verstärkten antikörpervermittelten Zytotoxizität übereinstimmt.

Im Gegensatz dazu zeigte die Isotyp-Kontrollbedingung eine Überlebensrate von etwa 62 %, vergleichbar mit der NK-allein-Bedingung. Die Degranulation der NK-Zellen war am niedrigsten in der Koinkubation von NK-Zellen und Zielzellen ohne Antikörper und am höchsten in der mit Daratumumab behandelten Bedingung mit etwa 31 %, während die Isotyp-Kontrolle eine mittlere Degranulation mit etwa 19 % aufwies. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die natürliche Zytotoxizität von NK-Zellen zu quantifizieren, die Tumortötungspotenz von CAR-NK-Konstrukten zu bewerten und die ADCC-Wirksamkeit monoklonaler Antikörper zu vergleichen. Ein wesentlicher Aspekt bei der Durchführung dieses Protokolls ist die sorgfältige und konsistente Zellzählung, Pipettierung und Auftragung von NK- und Zielzellen, um zuverlässige und interpretierbare Ergebnisse sicherzustellen.

Zukünftige Studien können diese Protokolle nutzen, um die Immunevasion von NK-Zellen zu untersuchen, die Tumoranfälligkeit zu vergleichen und neuartige, auf NK-Zellen basierende Immuntherapien bei verschiedenen Krebserkrankungen zu bewerten.