Herstellung von einlagigen Graphen-beschichteten Gittern für die Kryoelektronenmikroskopie
8. September 2023
Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Auftragen einer einzelnen Monoschicht aus Graphen auf Elektronenmikroskopie-Gitter und wie sie für die Verwendung in der KryoEM-Strukturbestimmung vorbereitet werden können.
Die optimale Konservierung biologischer Proben ist derzeit eine große Herausforderung bei der Gewinnung hochauflösender KryoEM-Strukturen. Während des Probenvorbereitungsprozesses werden die Proben einer hydrophoben Luft-Wasser-Grenzfläche ausgesetzt, die denaturierende Auswirkungen auf die Proben hat und dazu führen kann, dass stabile Proben eine bevorzugte Ausrichtung im Eis einnehmen, was eine hochauflösende Strukturbestimmung verhindert. Die Beschichtung von CryoEM-Gittern mit einer dünnen Kohlenstoffschicht aus weichem Graphenoxid wird häufig verwendet, um Probleme im Zusammenhang mit Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche zu lösen.
Diese Schichten verstärken jedoch oft das Hintergrundrauschen in unseren Bildern, was die Auflösung unserer Struktur beeinträchtigt. Die Beschichtung des Gitters mit einer Monoschicht aus Graphen erreicht einen ähnlichen Schutz, ohne nennenswerte Hintergrundgeräusche zu erzeugen. Die Verwendung von graphenbeschichteten CryoEM-Gittern kann dazu beitragen, Probleme im Zusammenhang mit Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche zu lösen, kommerzielle Graphengitter sind jedoch teuer und viele Labore halten Graphengitter für zu kompliziert, um sie intern herzustellen.
Forscher auf dem Gebiet der KryoEM können nun dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll verwenden, um Dutzende von qualitativ hochwertigen Graphenen an einem Tag vollständig zu reproduzieren.
Übersicht
Diese Studie beschäftigt sich mit der Herausforderung, biologische Proben für die hochauflösende Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) optimal zu konservieren. Die Autoren stellen ein Protokoll zur Beschichtung von EM-Gittern mit einer einzelnen Graphen-Monoschicht vor, um Hintergrundrauschen zu minimieren und die Probenechtheit während der Bildgebung zu verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Kryo-Elektronenmikroskopie
- Probenerhaltung in der biologischen Bildgebung
- Graphen-Anwendungen in der Mikroskopie
Hintergrund
- Die Konservierung biologischer Proben ist entscheidend für hochauflösende Kryo-EM-Strukturen.
- Herkömmliche Kohlenstoffbeschichtungen können das Hintergrundrauschen in der Bildgebung erhöhen.
- Graphen bietet eine Schutzschicht, ohne die Bildqualität zu beeinträchtigen.
Verwendete Methoden
- Anwendung einer einlagigen Graphenschicht auf EM-Gittern
- Kryo-EM-Aufnahmetechniken
- Verwendung selbstgebauter Spin-Beschichtungsgeräte und verschiedener Reinigungsmittel
Hauptergebnisse
- Graphenbeschichtete Gitter zeigen bei der Bildgebung ein reduziertes Hintergrundrauschen.
- Die Methode ermöglicht die Massenproduktion von hochwertigem Graphen innerhalb eines einzigen Tages.
- EM-Gitter weisen eine effektive Konservierung und Konzentration biologischer Proben auf.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine unkomplizierte Methode für Labore, mit Graphen beschichtete EM-Gitter herzustellen.
- Dieser Fortschritt erhöht das Potenzial für verbesserte Kryo-EM-Aufnahmen in der biologischen Forschung.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Kryo-EM mit hoher Auflösung ist entscheidend für die Strukturbiologie und die Arzneimittelforschung, doch die Denaturierung der Probe und Orientierungsartefakte an der Luft-Wasser-Grenzfläche beeinträchtigen die Datenqualität und den Durchsatz. Gitter mit einer Monolage Graphenbeschichtung beheben diese Engpässe, indem sie die Integrität makromolekularer Strukturen bewahren und das Hintergrundrauschen verringern, was sich direkt auf die frühe Entdeckung und Zielvalidierung auswirkt. Die skalierbare in-house-Herstellung von Graphen-Gittern ermöglicht eine breitere Anwendung und unterstützt strukturelle Studien über das gesamte Portfolio hinweg sowie eine beschleunigte mechanistische Entwederung von Risiken.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine hochpräzise strukturelle Untersuchung makromolekularer Komplexe zur Zielvalidierung.
- Reduziert Denaturierung und Aggregation und unterstützt so die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase.
- Verbessert die Orientierungsvielfalt und erhöht damit die Vorhersagesicherheit bei strukturellen Modellen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erleichtert die Herstellung reproduzierbarer Kryo-EM-Gitter mit geringem Hintergrund für die nachgeschaltete Analyse.
- Unterstützt die quantitative Bildgebung, indem Rauschen und Konzentrationsartefakte minimiert werden.
- Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung von Protein-Komplexen bei niedrigeren Probenkonzentrationen.
Translationale und präklinische Forschung
- Verbessert die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem robuste strukturelle Datengenerierung unterstützt wird.
- Ermöglicht eine bessere Anbindung an die translationale Biomarker-Entwicklung durch verbesserte strukturelle Auflösung.
- Verringert das Risiko von Fehlschlägen in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien aufgrund mehrdeutiger oder fehlerhafter Strukturdaten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Gitter mit einkristallinem Graphen beschichtet integrieren sich in die Kryo-EM-Arbeitsabläufe von der frühen Entdeckung bis hin zur Leitstrukturfestlegung und präklinischen Forschung, unterstützen hypothesengetriebene strukturelle Untersuchungen und ermöglichen reproduzierbare, hochwertige Abbildungen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch die Erhaltung nativer makromolekularer Konformationen.
- Screening: Bietet standardisierte, reproduzierbare Raster für quantitative Kryo-EM-Analysen.
- Analytik: Liefert geräuscharme, hochauflösende Bilder für eine robuste vergleichende Analyse.
- Translationale Forschung: Verbessert die präklinische Kontinuität, indem sie eine zuverlässige strukturelle Charakterisierung von Wirkstoffkandidaten ermöglicht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine skalierbare, kosteneffiziente Plattform für wiederholte strukturelle Untersuchungen über verschiedene Programme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in der Strukturbiologie.
- Operativer Wert: Standardisiert die Gitterpräparation, verbessert die Reproduzierbarkeit und ermöglicht die Skalierung in Chargen.
- Strategischer Wert: Beschleunigt Go/No-Go-Entscheidungen und reduziert biologische Risiken in späteren Phasen durch qualitativ hochwertigere Daten.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung strukturell validierter Zielstrukturen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Expertise im Umgang mit Cryo-EM-Gittern und Graphen-Manipulation.
- Benötigt Zugang zu Schleuderbeschichtern, Abzugsanlagen und der üblichen Infrastruktur zur Vorbereitung von EM-Gittern.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus, um reproduzierbare Gitterqualität und Bildergebnisse zu erzielen.
- Kann je nach Protein-Klasse oder Probentyp Anpassungen erfordern.
- Mögliche Einschränkungen betreffen die Empfindlichkeit beim Handling sowie eine Einarbeitungszeit für die Graphen-Übertragungsschritte.
