Ein in vitro Assay zur Untersuchung der Thrombozytenmigration mit RGD-funktionalisierten Avidin-Biotin-Ethern

Blutplättchen sind entscheidend für die Verhinderung von Blutverlust nach Gefäßverletzungen, die Bekämpfung von Infektionen und die Aufrechterhaltung der Gefäßintegrität bei Entzündungen. Während hämostatische Pfropfen die kollektive Aktivierung und Aggregation von Blutplättchen erfordern, wird ihre Rolle beim Schutz der entzündeten Blutgefäße auf Einzelzellebene wahrgenommen. In diesem Zusammenhang haben neuere Studien herausgefunden, dass Blutplättchen autonom wandern können, ein Prozess, der von der Mechanosensorik ihrer adhäsiven Mikroumgebung abhängt.

Dieser Ansatz ermöglicht eine präzise Kontrolle der Adhäsionseigenschaften des Substrats und dient als einfacher In-vitro-Assay, um die Mechanismen zu untersuchen, die der Thrombozytenmigration zugrunde liegen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Migration von Blutplättchen, die an Integrin-Liganden binden, eine Kraft ausüben kann, die die Avidin-Biotin-Bindung stören kann. Dieser Assay bietet eine einfache und zuverlässige Methode zur Visualisierung der Thrombozytenmigration.

In Kombination mit der Bildgebung lebender Zellen wird es uns helfen, das Zusammenspiel und die Regulation verschiedener Komponenten des Zytoskeletts bei dieser wichtigen Thrombozytenfunktion besser zu verstehen. Zu Beginn beschallen Sie die Glasabdeckung eine Minute lang mit 20 % Salpetersäure, gefolgt von einer Beschallung mit Isopropanol, Ethanol und Wasser für jeweils eine Minute. Behandeln Sie die vorgereinigten Deckgläser zwei Minuten lang mit Sauerstoffplasma in einem Plasmareiniger und montieren Sie sie dann mit klebrigen Objektträgern.

Füllen Sie nun den Kanal mit 2,5 Mikrolitern PLL-PEG-Biotin, verdünnt in 97,5 Mikrolitern PLL-PEG, und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur, dann waschen Sie es dreimal mit PBS. Fügen Sie dann 100 Mikroliter Neutravidin-FITC hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur, dann waschen Sie es dreimal mit PBS. Zum Schluss 100 Mikroliter Cyclo-RGD-Biotin hinzufügen, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dreimal mit PBS waschen.

Nachdem Sie die Maus betäubt und die Brusthaut entfernt haben, führen Sie die Nadel zwischen der zweiten und dritten Rippe auf der linken Seite des Brustbeins ein, um Blut aus dem Herzen zu entnehmen. Mischen Sie das Blut mit einem Milliliter Tyrode-Puffer und zentrifugieren Sie es bei 70 g für 20 Minuten bei Raumtemperatur bei ausgeschalteter Bremse, dann nehmen Sie den oberen Teil mit plättchenreichem Plasma. Mischen Sie es mit drei Millilitern Tyrode-Puffer und fügen Sie 100 Nanogramm Prostacyclin pro Milliliter hinzu, um die Aktivierung der Blutplättchen zu verhindern.

Anschließend bei 1200 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 500 Mikrolitern Tyrode-Puffer resuspendieren. Messen Sie dann mit einem Hämozytometer die Thrombozytenzahl.

Nehmen Sie zunächst Maus-Blutplättchen in Biotin-Neutravidin-Biotin-cRGD-Beschichtungskanälen und zeichnen Sie die Live-Thrombozytenmigration mit einem inversen Mikroskop auf, das mit einem Tischinkubator ausgestattet ist. Um die Thrombozytenadhäsions- oder Migrationszahlen zu zählen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Dropdown-Menü des Punktwerkzeugs in der Symbolleiste und wählen Sie das Mehrpunktwerkzeug aus. Extrahieren Sie den Migrationsabstand von fixierten Proben, indem Sie die Länge des Migrationspfads messen, der in die Neutravidin-FITC-Beschichtung eingeprägt ist.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Dropdown-Menü des Geraden-Werkzeugs in der Symbolleiste und wählen Sie das Freihand-Werkzeug aus. Um die Form der Blutplättchen zu quantifizieren, wählen Sie in der Symbolleiste Bild, Anpassen und Schwellenwert aus, um binäre Masken zu erstellen, indem Sie fluoreszierende Blutplättchen segmentieren. Wählen Sie unter "Analysieren und Messwerte" die Option "Formdeskriptoren" aus, und wählen Sie dann "Ergebnisse mit Analysieren anzeigen" und "Partikel analysieren" aus.

Die Blutplättchen zeigten eine optimale Migration bei einer Konzentration von 2,5 %PLL-PEG-Biotin. Die Migration war sowohl bei niedrigeren als auch bei höheren Ligandendichten reduziert. Die Blutplättchen verteilten sich bei einer Ligandendichte von 1 % unzureichend, was durch eine geringe Fläche und einen geringen Umfang angezeigt wird, was auf eine unzureichende Integrinaktivierung hindeutet.

Bei einer Ligandendichte von 2,5 % verteilen sich die Blutplättchen effektiv, stören cRGD-Liganden und migrieren. Eine hohe Ligandendichte führte dazu, dass sich die Blutplättchen ohne Polarisation ausbreiteten, wodurch die Migration aufgrund des Versagens, cRGD-Liganden zu brechen, reduziert wurde.