Adhäsion und Aggregation unter Fluss mit Mikrofluidik-Flow-Cells

Das Bio-Flux-System ist ein automatisiertes Instrument und mikrofluidisches Gerät zur Durchführung von Lebendzell-Assays unter kontrollierter Scherströmung. Dieses System nutzt Mikrofluidik-Technologie in Mikrotiterplatten, um mikroskalige Durchflusskammern in SBS-konforme Mikrotiterplatten zu integrieren. BioFlex kann zur Durchführung von Untersuchungen zur Thrombozytenadhäsion und -aggregation mit hoher Durchsatzleistung und reduzierten Blutvolumina eingesetzt werden.

Ganzes Blut, das mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert wurde, wird in die Vertiefungen gegeben und anschließend durch die Kanäle geleitet. Unter kontrollierter Scherströmung werden hochauflösende Mikroskopiedaten erzeugt, die die Thrombozytenadhäsion und -aggregation in Gegenwart von Wirkstoffverbindungen und anderen variablen Parametern quantifizieren. Hallo, ich bin Mike Schwartz aus dem Forschungs- und Entwicklungs-Labor von Flexion Biosciences.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Verwendung von mikrofluidischen Flusszellen in Thrombozytenadhäsionsassays. Wir verwenden dieses Protokoll in unserem Labor für eine Vielzahl von Assays zur vaskulären Biologie. Beginnen wir also.

Bevor das Durchflusszellenexperiment durchgeführt wird, müssen die mikrofluidischen Kanäle der Bio-Flux-Platte mit einer Proteinkoatinglösung, z. B. Kollagen Typ I, die in diesem Experiment verwendet wird, vorbereitet werden. Jeder der 24 experimentellen Kanäle der Bio-Flux-Platte ist mit einem Eingangs- und einem Ausgangsbrunnen verbunden. Der Eingangsbrunnen ist der linke Brunnen, der den Kanal speist, der Ausgangsbrunnen befindet sich rechts. Verdünnen Sie den Kollagen-Typ-I-Stammlösung auf eine Konzentration von 200 Mikrogramm pro Milliliter.

In 0,02-molarer Essigsäure werden 20 Mikroliter pro verwendeten Kanal benötigt. Da dieses Experiment 11 Kanäle erfordert, stellen Sie 200 Mikroliter Kollagenbeschichtung her. Ein Kanal bleibt unbeschichtet und wird durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mit einer Mikropipettenspitze gemischt.

Geben Sie mithilfe einer Mikropipette jeweils 20 Mikroliter Beschichtungslösung in jeden Kanal, indem Sie die Flüssigkeit in den inneren Stempel des Wells geben. Füllen Sie den gewünschten mikrofluidischen Kanal, wie hier mit dem gelben Farbstoff gezeigt, und führen Sie einen Kanal ohne Kollagen als Negativkontrolle für die Thrombozytenadhäsion und -aggregation ein. Nachdem die Kollagenbeschichtung allen jeweiligen Kanälen hinzugefügt wurde, befestigen Sie die Schnittstelle an der Platte.

Wenn Sie die Bio Flux 1000-Schnittstelle verwenden, können Sie beide Verriegelungen auf der Bühne fixieren. Wenn Sie die Bio Flux 200-Schnittstelle verwenden, ziehen Sie zunächst mit dem Finger die vier Schrauben an. Sobald alle Schrauben eingesetzt sind, verwenden Sie den Drehmomentschlüssel, um sie vollständig festzuziehen.

Der Drehmomentschlüssel gibt ein Klicken von sich, wenn das Maximum erreicht ist. Wenden Sie mithilfe des manuellen Modus in der Bio-Flux-Software eine Perfusion auf die gewünschten Kanäle mit 2D pro Quadratzentimeter ab dem Auslass an. Verwenden Sie ein Objektiv mit niedriger Vergrößerung am Mikroskop, um das Einlass-Loch zu finden, und beobachten Sie, wie der gegenüberliegende innere Stempel mit Flüssigkeit gefüllt wird.

Sie sollten zunächst einen kleinen Tropfen Flüssigkeit sehen, der sich langsam nach mehreren Minuten mit dem inneren Stempel füllt; wenn der innere Stempel des Einlasses gefüllt ist, stoppen Sie die Zufuhr auf allen Kanälen, indem Sie im Software-Programm „Stop“ drücken. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur. Während dieser Inkubationszeit können Sie am Ende der einstündigen Inkubation mit der Vorbereitung des Vollbluts beginnen.

Nachdem das Blut vorbereitet wurde, entfernen Sie die Grenzfläche und geben Sie ein Milliliter PBS mit Calcium- und Magnesiumionen in den Auslass. Beginnen Sie die Perfusion aus dem Auslass-Well mit zwei Dynen pro Quadratzentimeter und setzen Sie die Perfusion 10 Minuten lang fort. Nach 10 Minuten beenden Sie die Perfusion. Nach dem Entfernen der Grenzfläche entfernen Sie überschüssiges PBS aus beiden, dem Einlass- und dem Auslass-Well.

Entfernen Sie niemals Flüssigkeit, die die innere Stanze füllt. Um die Kanäle zu blockieren, geben Sie ein Milliliter Blockierungslösung in jeden Auslass. Die Kammer, die verwendet werden soll, wird vom Auslasskammer bei zwei Dyn pro Quadratzentimeter perfundiert, und die Perfusion wird 10 Minuten lang fortgesetzt.

Beenden Sie die Perfusionsflüssigkeit nach 10 Minuten und entfernen Sie die Schnittstelle. Die Kanäle sind nun fertig und können während des ganzen Tages verwendet werden, während die Platte mit Kollagen beschichtet wird. Während einer einstündigen Inkubation sollte frisches menschliches Blut von einer nüchternen Person für die Bildgebung und das Durchlaufen durch die Platte vorbereitet werden.

Das Blut sollte in Natriumcitrat als Antikoagulans gezogen und innerhalb von drei Stunden nach der Entnahme verwendet werden. Zunächst wird ein vier Millimolarer Kalzium-M-Stammlösung in DMSO im Verhältnis 1 zu 1000 (Volumen pro Volumen) zum Blut gegeben. Um vier Mikromolare Kalzium zu erhalten, wird vorsichtig durch Inversion gemischt.

Als Nächstes pipettieren Sie ein Milliliter des mit Calcium markierten Blutes in zehn 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen. Geben Sie den GP2b3a-Inhibitorenantikörper in jeder gewünschten Verdünnung zu jedem Röhrchen hinzu. Stellen Sie sicher, dass eine negative Kontrolle ohne Antikörper sowie eine positive Kontrolle mit einem irrelevanten Antikörper enthalten ist, und mischen Sie vorsichtig durch Inversion.

Inkubieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter gelegentlicher Mischung durch vorsichtiges Umstülpen alle 10 Minuten, bevor das Flusszellenexperiment durchgeführt wird. Im Bio-Flux-Steuermodul sollte ein automatisiertes Protokoll für Kollagen.Eins eingerichtet werden. Richten Sie ein Protokoll ein, um das Blut 10 Minuten lang bei zehn hoch neun Quadratzentimetern am Auslass laufen zu lassen.

Nun, bei Verwendung der BioFlex 1000 Workstation sollten die Parameter für die Datenaufnahme eingerichtet werden, einschließlich der gewünschten Positionen der Probe in der FitZ-Wellenlänge und der Zeitraffer-Einstellung. Ein typischer Plan für die Bildaufnahme im Rahmen dieses Protokolls umfasst ein Sichtfeld pro Kanal, das mit einem 10x-Objektiv alle 30 Sekunden über eine Gesamtdauer von 10 Minuten aufgenommen wird. Weitere Sichtfelder und alternative Zeitraffer-Einstellungen sind ebenfalls möglich.

Nachdem das automatisierte Protokoll und die Parameter für die Datenerfassung eingerichtet wurden, kehren Sie zur BioFlex-Platte zurück und entfernen Sie die Flüssigkeit auf beiden Seiten des Kanals, mit Ausnahme der inneren Stanzungen. Achten Sie darauf, schnell zu arbeiten, und geben Sie 500 Mikroliter Blut jeder Bedingung in die Ausgabewells jedes Kanals. Beachten Sie, dass die Ausgabewells zur Applikation des Bluts verwendet werden, da dies der kürzeste Weg zur Beobachtungszone ist und somit eine unmittelbarere Reaktion des Bluts auf die Kollagenbeschichtung ermöglicht.

Platzieren Sie außerdem die Kontrollblutprobe ohne Antikörper in einen mit Kollagen beschichteten Kanal und einen, der nur blockiert ist. Stellen Sie die Platte auf das Mikroskop der BioFlex 1000-Workstation und befestigen Sie die Schnittstelle. Führen Sie die Kalibrierung der Probentabelle durch, indem Sie den ersten Kalibrierungspunkt lokalisieren, der als Ursprung definiert ist.

Danach den zweiten Kalibrierungspunkt suchen und markieren. Diese Kalibrierung auf die entsprechende Objektträgerliste anwenden. Dadurch wird sichergestellt, dass alle Betrachtungspositionen auf der Platte automatisch gefunden werden können.

Bewegen Sie den Objekttisch zu einem der Kanäle, die Blut enthalten. Passen Sie die Parameter für die Bildaufnahme wie Belichtungszeit und Verstärkung in der BioFlex-Montagesoftware an. Starten Sie den entsprechenden Arbeitsablauf, indem Sie auf die gewünschte Schaltfläche klicken. Dadurch wird das Flussprotokoll und die Bildaufnahme gleichzeitig gestartet.

Am Ende des Experiments die Platte vom BIOFLU 1000-Arbeitsplatz entfernen und gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgen. Unter Verwendung von kollagenbeschichteten mikrofluidischen Kanälen des Bio-Flux-Systems wird im unbehandelten Kontrollblutproben im Zeitverlauf eine aggressive Thrombusbildung beobachtet.

Im Gegensatz dazu wird bei dem unbeschichteten Kanal keine Thrombusbildung beobachtet. In einem kürzlich durchgeführten Experiment betrug die durchschnittliche Größe der Aggregate unter Kontrollbedingungen 2000 Quadratmikrometer. GP IIb IIIa ist ein potenter Vermittler von Plättchen-Plättchen-Wechselwirkungen und der Stabilisierung der Aggregation, wenn es durch Adhäsion an Kollagen aktiviert wird; wie hier gezeigt, nach Inkubation mit anti-GP IIb IIIa-Antikörper für eine Stunde vor der Scherbelastung, wird eine Verringerung der Größe der Thromben sowie eine Abnahme der Häufigkeit der Thrombusbildung beobachtet.

Eine dosisabhängige Antwort kann typischerweise bei zehn Neun Quadratzentimetern beobachtet werden, und der IC50-Wert für diesen speziellen Inhibitor betrug 17 Nanomolar. Die maximale Hemmung für diesen Spender im Vergleich zur Kontrolle ohne Antikörper betrug 11 % bei 10 Dine Quadratzentimetern. Eine 48-Well-Platte mit hohem Scherfluss ist ebenfalls verfügbar, um Ganzblutexperimente bis zu 200 D pro Quadratzentimeter oder 5.000 pro Sekunde durchzuführen.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man mikrofluidische Flusskanäle für physiologisch relevante Experimente zur Gefäßbiologie nutzen kann. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, die richtige Pufferlösung zum Verdünnen des Kollagens zu verwenden. Wenden Sie stets die korrekte Pipettier-Technik an, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, und befolgen Sie stets die Biosicherheitsvorschriften Ihres Labors.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.