Ein Elektroporationszytometrie-Protokoll für die Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen unter Verwendung von U2 OS-Zellkulturen

Der Schwerpunkt dieser Forschung liegt auf der Wirkung gepulster elektrischer Felder auf das Zellverhalten, insbesondere darauf, wie sich die Elektroporation auf den Zellzyklus auswirkt.

Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Möglichkeit, kontinuierliche Elektroporationsexperimente mit Lebendzellen mit Säugetierzellkulturen für bis zu 72 Stunden durchzuführen. Unser Labor konzentriert sich auf die Adaption dieser Techniken für die Mikrofluidik, die geringere Probengrößen, einen geringeren Reagenzienbedarf und eine bessere Probenkontrolle für zukünftige Protokolle ermöglicht.

[Erzähler] Kultivieren Sie zunächst U2OS FUCCI CA5-Zellen in einer 10-Zentimeter-Platte mit 10 Millilitern DMEM-hoher Glukose, die 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einer Umgebung mit 5 % Kohlendioxid. Wenn die Kultur eine Konfluenz von 80 % erreicht, aspirieren Sie das Medium von der Platte. Waschen Sie die Zellen mit PBS, fügen Sie dann einen Milliliter 0,25% Trypsin hinzu und inkubieren Sie 1,5 Minuten lang, um die Zellen zu dissoziieren. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie die dissoziierten Zellen in fünf Millilitern DMEM-hoher Glukose resuspendieren. Entnehmen Sie eine 100-Mikroliter-Probe aus der resuspendierten Kultur und legen Sie sie auf den unteren Glasdeckel in der Kammer des Elektroporationszytometriesystems. Stellen Sie sicher, dass die Kammer nach dem Einbringen der Probe zu 30 % konfluent ist. Geben Sie langsam vier Milliliter DMEM-Glukose in das hintere Ende der Kammer und verhindern Sie, dass die Flüssigkeit die Probe ausspült. Legen Sie einen Standard-Objektträger über die Kammer und inkubieren Sie die Kammer 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Schalten Sie das inverse Fluoreszenzmikroskop mit einer Klimakontrollkammer ein, damit sich das System vor der Elektroporation stabilisieren kann. Während sich die Klimakammer stabilisiert, verwenden Sie Krokodilklemmenkabel, um ein Digitalmultimeter an den Impulsgeneratorkondensator und den Hochspannungsschalter anzuschließen, um eine schnelle Einrichtung mit der Elektroporationskammer zu ermöglichen. Wählen Sie nun die 20-fache Vergrößerung am Mikroskop. Stellen Sie in der Mikroskopsoftware sicher, dass FITC/GFP und A594 Texas Red M Cherry-Kanäle ausgewählt sind, die den beiden fluoreszierenden Proteinen im FUCCI CA5-System entsprechen. Verwenden Sie niedrige Belichtungseinstellungen, in der Regel weniger als 0,05 Sekunden, um Lichtschäden bei Langzeitaufnahmen zu vermeiden. Nehmen Sie Testbilder auf, um den Bildfokus und die Bildqualität zu optimieren, bevor Sie mit der Zeitrafferaufnahme beginnen. Programmieren Sie den Zeitraffer so, dass er über einen Zeitraum von 24 Stunden alle 10 Minuten Bilder aus drei bis sechs verschiedenen Blickwinkeln aufnimmt, um eine große Menge an Zellzyklusdaten pro Zeitraffer zu erhalten und gleichzeitig Fotoschäden zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass der Autofokus für den A594-Kanal aktiviert ist, um die Verfolgung der Kultur während des Zeitraffers zu optimieren. Lassen Sie die Software geöffnet, bis die Elektroporation abgeschlossen ist. Setzen Sie die Elektroporationszytometriekammer in das Mikroskop ein, das mit einer entsprechenden Klimakammer ausgestattet ist. Halten Sie die Kammer vor der Elektroporation geschlossen und stellen Sie sicher, dass das Umgebungssystem in Betrieb bleibt, um die richtigen Bedingungen für den Zellzyklus aufrechtzuerhalten. Öffnen Sie die Klimakammer und schließen Sie ein Digitalmultimeter an den Impulsgenerator an. Verbinden Sie dann den Impulsgenerator mit Hilfe von Krokodilklemmenkabeln mit den Kammerelektroden. Laden Sie den Impulsgenerator-Kondensator auf 180 Volt auf. Entladen Sie den Impuls schnell in die Kammer, bis das Digitalmultimeter null Volt anzeigt. Entfernen Sie alle elektrischen Anschlüsse aus der Kammer und setzen Sie den Kammerdeckel umgehend wieder auf, um optimale Kultivierungsbedingungen zu gewährleisten. Aktivieren Sie die Zeitrafferbildgebung sofort, sobald die Klimakammer sicher an ihrem Platz ist. Nachdem der Zeitraffer abgeschlossen ist, verwenden Sie die Mikroskopsoftware, um alle aufgenommenen Bilder als einzelnes Video zu speichern. Passen Sie die visuelle Qualität an, um die Klarheit von Zellmerkmalen für die manuelle Quantifizierung zu verbessern. Beobachten Sie abschließend die Veränderungen der FITC- und A594-Signale im Laufe der Zeit, um die Zellphasen im Zeitraffervideo zu verfolgen. Mit dem Fuji-System wurden visuelle Daten gesammelt, indem Farbänderungen im Zusammenhang mit der Proteinexpression und Ubiquitinierung verfolgt wurden, was eine klare Unterscheidung zwischen G1-, S-, G2- und M-Phasen ermöglichte. Dies ermöglichte die direkte Beobachtung des Zellzyklusverlaufs unter verschiedenen Bedingungen. Diese Abbildung zeigt eine Zusammenfassung der Schlüsseldaten, die aus zwei Experimenten mit unsynchronisierten und S-Phasen-synchronisierten Zellkulturen gesammelt wurden. Die Exposition gegenüber gepulsten elektrischen Feldern in unsynchronisierten Zellen erhöhte die durchschnittliche Länge der G1-, G2- und M-Phasen signifikant, während die S-Phase unverändert blieb. In synchronisierten Zellen führte die Exposition mit gepulsten elektrischen Feldern zu einer verkürzten Dauer der G1-, S- und G2-Phasen, obwohl nur S und G2 statistisch signifikant waren, während die M-Phase nicht beeinflusst wurde.