Lysosomales Profiling mit LysoTracker zur quantitativen Bewertung der zellulären Seneszenz bei humanen Fibroblasten

Wir untersuchen die zelluläre Seneszenz und deren Charakterisierung und konzentrieren uns darauf, wie Merkmale wie lysosomale Veränderungen als Altersmarker dienen können. Konventionelle Senezenzmarker sind oft endpunktsbasiert und binär, während Live-Zell-Bildgebung die Seneszenz als kontinuierliches quantitatives Signal unter verschiedenen Bedingungen lesen kann. Zu Beginn säen Sie IMR-90-Fibroblasten in einer 24-Wellen-Platte aus und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in einem 5%-Kohlendioxid-Inkubator, bis sie eine subkonfluente Monoschicht bilden.

Zeichnen Sie die Saatdichte und die Zeit zwischen Anplattierung und lysosomaler Färbung für jedes Experiment auf. Erwärme das gesamte Kulturmedium auf 37 Grad Celsius. Bereiten Sie eine 75-nanomolare LysoTracker Deep Red Arbeitslösung in diesem Medium vor und schützen Sie sie vor Licht.

Mischen Sie die Arbeitslösung durch sanfte Inversion. Wählen Sie abgestimmte prä-seneszente und seneszente IMR-90 Fibroblast-Kohorten, die mit einer definierten Senescenzinduktionsmethode erstellt werden. Bestätigen Sie den seneszenten Phänotyp durch Überwachung der Wachstumsmerkmale und -morphologie.

Aspiriere das verbrauchte Medium aus jedem Brunnen. Fügen Sie die LysoTracker-Arbeitslösung vorsichtig entlang der Wand jedes Brunnens hinzu, um Störungen der Monoschicht zu vermeiden. Inkubieren Sie die Zellen mit LysoTracker 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem 5%-Kohlendioxid-Inkubator.

Während der letzten 10 Minuten der LysoTracker-Inkubation geben Sie Hoechst 33342 direkt zu den Brunnen, die vom Hersteller empfohlene Arbeitskonzentration empfohlen werden, und mischen Sie durch vorsichtiges Schaukeln der Platte. Am Ende der Inkubation entfernen Sie das Färbemedium und spülen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmtem PBS, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Unmittelbar nach der Spülung geben Sie vorgewärmtes Phenol-Rot-freies Kulturmedium dazu.

Fahren Sie direkt mit der Live-Zellbildgebung fort, wobei die Zeit vom Pufferaustausch bis zur Datenerfassung über alle Wells hinweg konstant bleibt. Kennzeichnen Sie die parallelen Brunnen in der Kulturplatte für eine Beta-Galaktosidase-Färbung, um hochseneszente Zellen mit den präseneszenten Kontrollen zu vergleichen. Vollständige Live-Cell-Bildgebung für die Validierungsbrunnen vor der Fixierung.

Zeichnen Sie die Bühnenkoordinaten während der Live-Aufnahme auf, um die gleichen Felder nach der Fixierung neu zu lokalisieren. Gib die Fixationslösung aus dem Alters-Beta-Galactosidase-Färbekit mit 2 % Formaldehyd und 0,2 % Glutaraldehyd zu den Zellen. Den Teller mit dem Deckel abdecken und 10 bis 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren lassen.

Entferne das Fixativ und spüle die Brunnen zweimal mit PBS aus. Dann geben Sie die Beta-Galactosidase-Färbungslösung mit dem X-gal-Substrat bei pH 6 zu jedem Brunnen. Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm, um die Verdunstung während der Inkubation zu begrenzen, und stellen Sie die Platte für 12 bis 16 Stunden in einen trockenen Inkubator bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid.

Nach der Fixierung und Färbung wird die Platte auf die Mikroskopstufe gelegt und dieselben Bildfelder anhand der aufgezeichneten Stufenkoordinaten neu positioniert. Untersuchen Sie die Brunnen unter einem Brightfield-Mikroskop und dokumentieren Sie das Färbungsmuster. Erfassen Sie repräsentative Bilder für jede Erkrankung und bestimmen Sie den Anteil der seneszenzassoziierten Beta-Galactosidase-positiven Zellen pro Bohrloch.

Senescente Zellen zeigten helle, räumlich erweiterte paranukleäre, lysosom-angereicherte Regionen, während prä-seneszente Kontrollen insgesamt ein geringeres Gesamtsignal mit diskreten punktaten Strukturen zeigten. Seneszente Bedingungen zeigten einen höheren Anteil beta-galpositiver Zellen als prä-seneszente Kontrollpersonen. Es wurde eine starke Korrelation zwischen der LysoTracker-Intensität und dem seneszenzassoziierten beta-gal-positiven Bereich in den Replikationsbrunnen beobachtet.

Die mittlere LysoTracker-Intensität innerhalb der positiven Maske war in seneszenten Kulturen höher als in prä-seneszenten Kulturen, was sie zum robustesten Feld-Diskriminator zwischen den beiden Bedingungen machte. Die integrierte LysoTracker-Intensität pro Kern war ebenfalls in seneszenten Kulturen im gezeigten repräsentativen Feld höher. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die lysosomale Remodellierung in lebenden Zellen zu messen und liefert so eine quantifizierbare Einzelzellanzeige der Altersbelastung und des Verlaufs.

Es ist wichtig, die Färbungs- und Bildeinstellungen in allen Quellen identisch zu halten, da Intensitätsvergleiche nur innerhalb einer Sitzung gültig sind. Zukünftige Studien können dieses Verfahren auf dreidimensionale Modelle, zusätzliche Zelltypen und Validierung in verschiedenen Mikroskopsystemen und Arbeitsabläufen ausweiten.