Immunoblot-Analyse

Die Immunschichtanalyse, häufig als Western Blotting bezeichnet, dient dazu, in einer Proteinprobe spezifische Antigene nachzuweisen, die von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern erkannt werden. Dieses Verfahren folgt typischerweise einer ein- oder zweidimensionalen Gelelektrophorese und beinhaltet den Transfer der getrennten Proteine auf Nitrocellulosemembranen. Die Inkubation dieser Membranen mit primären und sekundären Antikörpern, die direkt oder indirekt mit Enzymen konjugiert sind, sowie die Sichtbarmachung der Proteinantigene auf diesen Membranen mittels farbiger oder fluoreszierender Substratreaktionen.

In diesem Video zeigen wir eine schrittweise Demonstration eines Immunschichtverfahrens. Hallo, ich bin Sean Gallagher vom UVPI in Zusammenarbeit mit einem Proteomikzentrum hier am KE Graduate Institute. Heute werde ich Ihnen die Immunschichtanalyse vorführen.

Es umfasst mehrere Schritte, darunter die Trennung von Proteinen, das Übertragen der Proteine auf Membranen, die immunologische Detektion sowie die Visualisierung mit chromogenen und chemilumineszenten Substraten. Beginnen wir also. Vor dem Start des Immunoblotting-Verfahrens müssen die Proteinproben zunächst mittels Elektrophorese unter Verwendung kleiner oder standardgroßer ein- oder zweidimensionaler Gele getrennt werden.

Bereiten Sie die antigenen Proben vor und geben Sie sie in die Gellöcher ein. Fügen Sie in eine oder mehrere Gellöcher vorgefärbte oder biotinylierte Proteine sowie Standards für das Molekulargewicht ein. Diese Proteinmarker übertragen sich auf die Membran und zeigen nach der Immunfärbung bequem die Membranorientierung und die Größen der Proteine an. Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, können wir die Immunschicht aufbauen.

Um den Immuno-Blot zusammenzubauen, nehmen Sie zuerst das Gel-Sandwich auseinander und entfernen Sie das Trägersystem. Äquilibrieren Sie das Gel 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Transferpuffer. Diese Äquilibrierung ist erforderlich, um eine Größenänderung des Gels während des Transfers zu verhindern. Während das Gel äquilibriert, beginnen Sie mit dem Aufbau des Transfer-Sandwichs in einem genügend großen Behälter, um die Kunststoff-Transferkassette aufzunehmen. Füllen Sie den Behälter mit Transferpuffer, sodass die Kassette bedeckt ist. Legen Sie nun ein Scotch-Brite-Pad oder einen Schwamm auf die untere Hälfte der Kunststoff-Transferkassette.

Danach ein Blatt Filterpapier nehmen, das auf die gleiche Größe wie das Gel zugeschnitten wurde. Mit Transferpuffer vorbenetzen und auf das Scotch-Bright-Pad legen. Sobald die 30-minütige Gel-Aquilibrierung abgeschlossen ist, das Gel auf das Filterpapier legen.

Entfernen Sie Luftblasen zwischen Gel und Filterpapier, indem Sie vorsichtig ein Reagenzglas oder einen Glasstab über die Oberfläche des Gels rollen. Alternativ können Sie die BioRad-Rolle verwenden, die zum BioRad-Kit gehört. Denken Sie daran, Handschuhe zu tragen, wenn Sie Filterpapiere, Gele und Membranen handhaben.

Öl von Ihren Händen blockiert die Übertragung. Bereiten Sie als Nächstes die Transfermembran vor. Schneiden Sie die Membran auf die gleiche Größe wie das Gel, wobei an jeder Kante ein bis zwei Millimeter hinzukommen.

Danach die Membran langsam mit einer Kante in einem Winkel von 45 Grad in destilliertes Wasser legen; das Wasser zieht durch Kapillarwirkung in die Membran und benetzt schließlich die gesamte Oberfläche. Wird sie zu schnell ins Wasser eingeführt, bleibt Luft eingeschlossen und erscheint als weiße Flecken auf der Membran. Auf diese Bereiche wird das Protein nicht übertragen.

Nachdem die Membran vollständig benetzt ist, equilibrieren Sie sie 10 bis 15 Minuten in Übertragungspuffer. Dieses Benetzungsverfahren funktioniert für Nitrocellulose- und Nylonmembranen. Nur PVDF-Membranen sind hydrophob und benetzen sich nicht einfach durch Eintauchen in destilliertes Wasser oder Übertragungspuffer.

PVDF-Membrane müssen zunächst für ein bis zwei Sekunden in 100 % Methanol getaucht und anschließend 10 bis 15 Minuten im Transferpuffer equilibriert werden. Das Membran darf zu keinem Zeitpunkt austrocknen.

Falls dies der Fall ist, die Membran erneut nass mit Methanol und anschließend mit dem Transferpuffer benetzen. Sobald die Membran bereit ist, die vorbenetzte Membran direkt auf die obere Seite des Gels legen. Dabei sicherstellen, dass alle Luftblasen zwischen Gel und Membran entfernt werden, indem man vorsichtig ein Reagenzglas, einen Glasstab oder eine BioRad-Rolle über die Oberfläche der Membran rollt.

Befeuchten Sie anschließend ein weiteres Stück Watman-Filterpapier mit drei mm Dicke. Legen Sie es dann auf die Membran und entfernen Sie erneut alle Luftblasen. Danach platzieren Sie ein weiteres Scotch-Brite-Pad oder einen Schwamm auf diesem Filterpapier.

Schließen Sie den Immuno-Blot-Sandwich ab, indem Sie die obere Hälfte der Transferröhre fixieren. Nun, da der Immuno-Blot-Sandwich zusammengesetzt ist, können wir die Proteine vom Gel auf die Membran übertragen. Füllen Sie zur Durchführung des Transfers den Elektroblottank mit Transferpuffer und platzieren Sie die Transferröhre mit dem Sandwich in der Elektroblotvorrichtung.

Es ist wichtig, das Sandwich so einzulegen, dass die Membran der Anode oder der positiv geladenen Seite des Tanks zugewandt ist. Schließen Sie die Kabel der Stromversorgung an die entsprechenden Anoden- und Kathodenseiten der Elektroblotting-Apparatur an. Dieser spezielle Blotter verfügt über einen Kühl-Eisblock.

Übertragen Sie nun die Proteine elektrophoretisch von dem Gel auf die Membran für 30 bis 60 Minuten bei 50 Volt mit Kühlung oder über Nacht bei 14 Volt im Kühlschrank. Sobald der Transfer abgeschlossen ist, schalten Sie das Netzteil aus und zerlegen Sie die Apparatur. Entfernen Sie anschließend die Membran aus der Blotting-Apparatur und markieren Sie die Orientierung, indem Sie eine Ecke abschneiden.

An diesem Punkt können die Membranen getrocknet und ein Jahr lang in einem wiedervers verschließbaren Plastikbeutel bei vier Grad Celsius gelagert werden. Vor der weiteren Verarbeitung müssen getrocknete PVDF-Membranen in eine kleine Menge 100 % Methanol gegeben werden, um die Membran zu benetzen. Danach in destilliertes Wasser, um das Methanol zu entfernen.

Wenn die Orientierung markiert ist, färben Sie das Gel, um die Übertragungseffizienz zu überprüfen. Um die übertragenen Proteine sichtbar zu machen, können Sie die Membran entweder reversibel mit Cipro-Rot oder irreversibel mit Kamasi-Blau Indiantinte, Naphtholblau oder kolloidalem Gold anfärben. Diese irreversiblen Färbeprozesse sind mit Nylonmembranen nicht kompatibel.

Nachdem die Proteine auf die Membran übertragen wurden, fahren Sie mit der immunologischen Detektion und visuellen Nachweis der Proteine fort. In diesem Schritt werden die immobilisierten Proteine auf der Membran mit spezifischen Antikörpern behandelt, um vorhandene Antigene zu identifizieren und zu quantifizieren. Beginnen Sie damit, die Membran in eine Kunststoff-Inkubationswanne mit 20 Milliliter Blockierpuffer zu legen.

Einige Personen verwenden Beutel, aber die Schalen werden oft bevorzugt, da sie besonders nützlich sind, wenn eine große Anzahl von Streifen in verschiedenen Primärantikörperlösungen verarbeitet wird. Anschließend inkubieren Sie die versiegelte Membran 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren auf einem horizontal schwingenden Schüttler oder Schwenkplatte. Während die Membran inkubiert, verdünnen Sie den Primärantikörper in Blockierpuffer.

Die Verdünnung wird empirisch bestimmt, liegt jedoch typischerweise zwischen eins zu 100 und eins zu 1000. Bei einem polyklonalen Antikörper beträgt sie eins zu 10 bis eins zu 100 für Hybrid-Supernatanten und mehr als eins zu 1000 für murine Aszitesflüssigkeit, die monoklonale Antikörper enthält. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, gießen Sie den Blockierpuffer aus.

Ersetzen Sie den Puffer durch verdünntes primäres Antikörperreagenz und inkubieren Sie erneut 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren. Waschen Sie anschließend die Membran viermal durch Schütteln mit 100 Milliliter TTBS für NITROCELLULOSE- oder PVDF-Filter bzw. TBS für Nylonfilter.

Spülen Sie jeweils 10 bis 15 Minuten lang, während die Membran gewaschen wird, verdünnen Sie den sekundären Antikörper in Blockpuffer. Beispiele für sekundäre Antikörper sind mit Pferderadishperoxidase oder alkalischer Phosphatase markierte Anti-Ig-Konjugate, die kommerziell als enzymkonjugierte Reagenzien erhältlich sind. Sekundäre Antikörper werden üblicherweise vor der Anwendung im Verhältnis 1:200 bis 1:25.000 verdünnt.

Nachdem die Waschschritte abgeschlossen sind und die Waschmaterialien entsorgt wurden, fügen Sie verdünntes Pferderadish-Peroxidase- oder Alkalische-Phosphatase-Anti-IG-Konjugat hinzu und inkubieren Sie 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur unter ständiger Agitation. Nach 30 bis 60 Minuten entfernen Sie die Membran aus der Wanne und waschen sie viermal, jeweils 10 bis 15 Minuten lang, in TTBS, wie zuvor beschrieben.

Nach Abschluss der Waschschritte können wir mit dem Visualisierungsschritt fortfahren. Zuvor werden wir jedoch ein alternatives Immunnachweisverfahren demonstrieren. Dieses alternative Immunnachweisverfahren basiert auf dem Vector-Stain-ABC-Kit von Vector Labs.

Es verwendet einen Avidin-Biotin-Komplex, um dem biotinylierten sekundären Antikörper entweder Horse-Radish-Peroxidase (HRP) oder alkalische Phosphatase (AAP) anzukoppeln. Heute werden wir das HRP-Kit demonstrieren. TTBS eignet sich hervorragend als Blockpuffer für Avidin-Biotin-Systeme.

Bei Nylonfiltern werden jedoch Protein-Bindungsreagenzien empfohlen, da Magermilchpulver Reste von Biotin enthält, das die Immunassay beeinträchtigen würde. Es muss nur im Blockierungsschritt verwendet werden, um die Membran in einem offenen Behälter unter ständigem Rühren mit einem Orbitalschüttler oder Schüttelplatform in Blockierpuffer zu equilibrieren. Inkubieren Sie die Membran 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur, während die Membran equilibriert wird.

Bereiten Sie die Primärantikörperlösung vor. Verwenden Sie TTBS für NITROCELLULOSE- oder PVDF-Membranen mit hochsensitiven Aden. Biotin-Systemen.

Die Verdünnung von Zera, das primären Antikörper enthält, liegt im Allgemeinen zwischen 1:1000 und 1:100.000. Bei Verwendung von chemilumineszierender Chemie sind höhere Verdünnungen erforderlich. In unserem Fall erfolgt der Nachweis chromogen.

Wir verwenden eine Verdünnung des Primärantikörpers im Verhältnis 1:5.000. Sobald die Äquilibration abgeschlossen ist, entfernen Sie den Blockierpuffer. Anschließend geben Sie so viel Lösung mit dem Primärantikörper hinzu, dass die Membran bedeckt ist.

Incubieren Sie die Membran nach 30 Minuten 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Waschen Sie die Membran dreimal mit TTBS für Nitrocellulose in Abständen von jeweils fünf Minuten. Während des Waschschritts bereiten Sie die biotinylierte sekundäre Antikörperlösung vor, indem Sie einen Tropfen biotinylierten Antikörper mit 10 Milliliter TTBS verdünnen. Sobald die Waschschritte abgeschlossen sind, geben Sie die sekundäre Antikörperlösung hinzu.

Die Membran 30 Minuten bei Raumtemperatur unter langsamer Schüttelbewegung inkubieren, während die Membran mit sekundärem Antikörper inkubiert wird. Bereiten Sie das Avadon-Biotin-HRPO hierfür vor. Mischen Sie zwei Tropfen Vti-Färbelösung A und zwei Tropfen Lösung B in 10 Milliliter.

TTBS für Nitrocellulose. Inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur, nachdem die Inkubation mit der sekundären Antikörperlösung abgeschlossen ist. Waschen Sie die Membran dreimal innerhalb von 15 Minuten mit TTBS oder TBS.

Fügen Sie als Nächstes die Avidin-Biotin-Enzym-Lösung auf die Membran hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur mit langsamer Schüttelbewegung. Anschließend waschen Sie die Membran dreimal im Abstand von jeweils 10 Minuten mit TTBS. Nach Abschluss des Immunnachweises sind die an die Membran gebundenen Proteine bereit, mit chromogenen Substraten sichtbar gemacht zu werden.

Für diesen letzten Visualisierungsschritt werden die Substrate 4-CN dab/ICL 2 und TMB üblicherweise bei immunologischen Nachweisverfahren auf Basis von Rettichperoxidase eingesetzt. Wenn die letzte Membranwäsche während des Immunprobenverfahrens in TTBS durchgeführt wurde, waschen Sie die Membran anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 50 Milliliter TBS. Bringen Sie die Membran nun in die chromogene Visualisierungslösung.

Proteinbanden sollten innerhalb von 10 bis 30 Minuten erscheinen. Nach der 30-minütigen Inkubation verwerfen Sie das Substrat-Reaktionsgemisch und beenden die Reaktion durch Zugabe von destilliertem Wasser. Die Immunoblot-Analyse ist ein mehrstufiges Verfahren, das von Tausenden von Laboren zur Detektion spezifischer Proteine nach eindimensionaler oder zweidimensionaler Elektrophorese verwendet wird.

Ich habe Ihnen soeben gezeigt, wie man eine immunologische Blutanalyse durchführt. Damit sind wir am Ende. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten und danke fürs Zuschauen.