Generierung von Knochenmark murinen dendritischen Zellen für den Einsatz in 2-Photonen-Imaging

Die Herstellung von dendritischen Zellen aus Knochenmark liefert eine hervorragende Quelle an antigenpräsentierenden Zellen, die für in-vitro- oder in-vivo-Experimente in der Zwei-Photonen-Bildgebung des Immunsystems verwendet werden können. Die Einführung von antigenpräsentierenden Zellen ermöglicht die Untersuchung antigenspezifischer Zell-Zell-Interaktionen im Kontext des lebenden Lymphknotens. Hier demonstrieren wir die sterilen Isolierung des Knochenmarks sowie Kultivierungstechniken zur Herstellung reifer dendritischer Zellen.

Außerdem verfolgen wir die Entwicklung dendritischer Zellen vom ersten bis zum elften Tag. Diese Entwicklung wird anhand von Standbildern und Inkubatorvideos dargestellt, die mit der Scent-Technologie Incus Site aufgenommen wurden. Schließlich zeigen wir, wie aus Knochenmark stammende dendritische Zellen in dem zugehörigen Lymphknoten ein Cove-Antigen gegenüber OT-zwei-T-Zellen präsentieren.

Hallo, ich bin Melanie Matthew im Labor von Micah Halen an der University of California in der Nähe. Haben Sie sich jemals gefragt, was währenddessen im Prober vor sich geht, während Ihre Zellen wachsen? Heute?

Als Teil unseres Protokolls zeigen wir Ihnen, wie man S einige Instrumente vor Ort verwendet. Mit dem Inky-Gerät können Sie das Wachstum der Zellkultur in Ihrem Inkubator verfolgen. In diesem Protokoll zeigen wir Ihnen, wie man aus Knochenmark stammende und Gruppenzellen von der Maus isoliert und vorbereitet.

Als Erstes zeige ich Ihnen, wie man Femurknochen entfernt und das Knochenmark isoliert. Befestigen Sie zunächst das Tier. Danach benetzen Sie das Tier mit 70 % Ethanol. Führen Sie dann einen ersten Schnitt entlang der Mittellinie des Tieres durch.

Schneiden Sie dann wie hier gezeigt innerhalb des Beins. Um das Muskelgewebe oberhalb des Femurs freizulegen, sollten Sie den Muskel beiseiteschieben und mit der anatomischen Pinzette den großen Femurknochen greifen können. Halten Sie den Knochen mit der anatomischen Pinzette fest, führen Sie die Pinzette am Knochen entlang nach unten und setzen Sie den ersten Schnitt direkt unterhalb des Gelenks an.

Bewegen Sie dann die Schere entlang der Länge des Femurs und schneiden Sie so nah wie möglich am Körper. Dies kann etwas Blut verursachen, insbesondere wenn Sie die Arteria femoralis durchtrennen. Beim Entfernen des Femurs ist es äußerst wichtig, dass der Knochen intakt bleibt.

Wie Sie hier sehen können, sind die Enden des Knochens nicht durchtrennt oder beschädigt worden. Sobald der Femur entfernt wurde, entfernen Sie zusätzliches Gewebe und legen den Femur in eine kleine Schale mit unserem PMI-Medium. Achten Sie beim Entfernen des zusätzlichen Gewebes darauf, dass der Femurknochen nicht austrocknet.

Zu diesem Zeitpunkt sollten die Femurknochen in eine Schale mit 70 % Ethanol überführt und für fünf bis zehn Minuten auf Eis gelegt werden. Für die Zwecke dieses Videos werden wir am Laborarbeitsplatz fortfahren. Zu diesem Zeitpunkt des Experiments sollten jedoch alle Arbeitsschritte in einer Zellkulturwerkbank durchgeführt werden.

Nachdem die Knochen in Ethanol eingelegt wurden, können sie in eine größere Schale mit sterilen Medien überführt werden, um das Knochenmark zu entfernen. Nun sind wir bereit, das Knochenmark zu entnehmen und erneut in Suspension zu bringen. Füllen Sie eine Insulinspritze mit sterilen Medien und legen Sie sie für den späteren Gebrauch beiseite.

Greifen Sie den Knochen mit sterilen Pinzetten. Halten Sie ihn über eine kleine Schale für Ausschussstücke und schneiden Sie die Epiphysen oder Enden des Knochens an beiden Seiten ab. Führen Sie Ihre Insulinspritze von einer Seite in den Knochen ein und spülen Sie das Mark aus dem Knochen in 15 ml Medium aus.

Spülen Sie das Knochenmaterial ein- oder zweimal erneut aus, bis das gesamte Mark herausgespült ist. Sobald das Mark vollständig aus dem Knochen entfernt ist, wird dieser nahezu vollständig weiß erscheinen. Legen Sie den gereinigten Knochen in die Entsorgungsschale und wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Femur.

Wenn dies abgeschlossen ist, lösen Sie vorsichtig alle Markstücke auf, die durch den Waschvorgang nicht bereits zerkleinert wurden, um eine Einzelzell-Suspension herzustellen. Dies erfordert fünf bis zehn Minuten Pipettieren. Geben Sie die Einzelzell-Suspension in ein 50-mil-konisches Reagenzglas und waschen Sie die Platte mindestens dreimal mit jeweils 10 mil Medium.

Immer wieder die Zellen abzentrifugieren, das Medium entfernen und die Zellen aufnehmen, indem man den Boden des Röhrchens fest und zügig mit den Fingern abstreift. Um die roten Blutkörperchen oder RBCs zu entfernen, führen wir eine Wasserlyse durch. Eine andere Methode zur Entfernung roter Blutkörperchen ist die Lyse mit Ammoniumchlorid.

Beide Methoden wurden in früheren JoVE-Videoartikeln beschrieben. Die Isolierung von CD4-positiven T-Zellen aus murinen Lymphknoten mithilfe der Milan-MAX-Reinigung in JoVE-Ausgabe neun und die Herstellung von T-Zell-Wachstumsfaktor aus Rat-zyten in JoVE-Ausgabe 10.

Nach der Entfernung Ihrer Erythrozyten sind Sie nun bereit, kultiviert zu werden. Bevor ich Sie jedoch durch die Dendritische-Zell-Kultur führe, möchte ich Ihnen den Incus-Ort vorstellen. Der Incus-Ort ermöglicht es, das vorhersehbare Zellkulturwachstum im Brutschrank zu verfolgen, sodass wir beobachten können, wie sich unsere Zellen verhalten oder fehlverhalten.

Nachdem eine Kultur eingerichtet wurde, platzieren Sie sie in der entsprechenden Schale und schieben die Inkubationsstelle zu. Anschließend stellen Sie am Computer einfach das Zeitintervall ein, wählen die Gewebskulturschalen aus, die Sie abbilden möchten, und lassen die Inkubationsstelle die Daten für Sie sammeln. Die Filme, die Ihnen in diesem Protokoll gezeigt werden, demonstrieren Veränderungen der Dendritischen-Zell-Morphologie in vitro.

Diese Videos wurden direkt aus dem Incus-Website-Programm exportiert. Während sich die dendritischen Zellen vom ersten bis zum elften Tag entwickeln, kann man eine tatsächliche morphologische Veränderung beobachten, da sie sich vergrößern und das Phänotyp der dendritischen Zelle annehmen. Nach dem Lysevorgang und der Entfernung der roten Blutkörperchen werden die Zellen in primärem dendritischen Zellmedium gewaschen und mit fünf Millionen pro Milliliter ausplattiert.

Diese Zellen sollten zunächst in einem primären Dendritischen-Zellen-Kulturmedium kultiviert werden; anschließend werden sie in sekundärem DC-Medium kultiviert, das mit 40 Nanogramm pro Milliliter IL-4 und 100 Nanogramm pro Milliliter TNF-α ergänzt ist. Diese Zytokine unterstützen die Entwicklung reifer dendritischer Zellen, die dendritischen Zellen aus Monozyten ähneln. Nun zeige ich Ihnen, wie die Kulturen während ihrer Entwicklung aussehen und wie sie im Zeitverlauf gepflegt werden.

Nachdem Sie die Zellen ausplattiert haben, können Sie die dendritischen Zellen 72 Stunden lang kultivieren, bevor Sie das erste Mal das Medium wechseln. So sieht Ihre typische Kultur kurz nach dem Ausplattieren der Zellen am ersten Tag aus. Und so sehen die Zellen aus.

Am dritten Tag können Sie erkennen, dass die Zellen begonnen haben, sich an der Platte anzulagern, jedoch noch nicht das klassische dendritische Zellphänotyp angenommen haben. Am vierten Tag entfernen Sie das Medium und geben 10 ml frisches primäres DC-Medium hinzu, nachdem Sie das alte Medium abpipettiert haben. Am vierten Tag entfernen wir außerdem Lymphozyten und alle anderen nicht-angewachsenen Zellen.

Sie können die Zellen nun für weitere drei Tage in den Inkubator zurückstellen, sieben Tage nach der ursprünglichen Aussaat. So sieht eine typische Kultur zu diesem Zeitpunkt aus. Sie erkennen, dass es Zeit ist, die Zellen zu teilen und umzupropagieren.

Am siebten Tag werden die dendritischen Zellen durch Absaugen des Mediums von der Platte entfernt, anschließend werden 300 Millimolar sterile EDTA hinzugefügt und fünf Minuten lang inkubiert. Danach wird die Platte wiederholt gespült, indem sie in einem Winkel von 45 Grad gehalten und die EDTA-Lösung mit der Pipette gegen die Rückseite der Platte gespült wird. Dies wird mehrere Minuten lang durchgeführt, um sicherzustellen, dass alle anhaftenden dendritischen Zellen entfernt werden.

Die Zellen werden in einem 50-Milliliter-Konischgefäß gesammelt und zweimal mit sekundärem DC-Medium gewaschen. Anschließend werden die Zellen resuspendiert und mit fünf Millionen Zellen pro Platte ausplattiert. Kürzlich umgepflanzte dendritische Zellen vom Tag sieben setzen sich rasch auf den Boden der Platte ab, haften an und beginnen, sich auszubreiten.

Wie Sie hier im Video der Zichy-Studie sehen können, wurde dieses Video über einen Zeitraum von zwei Tagen im Inkubator aufgenommen, um die dendritische Zellentwicklung von der anfänglichen Umpflanzung am Tag sieben bis zum frühen Tag neun zu zeigen. Morphologisch können dendritische Zellen durch einen Antigenpuls aktiviert werden, indem hier zwei Mikrogramm pro Milliliter LLPS mit hundert Mikrogramm Ova für die Verwendung mit aus OT-2-Mäusen gewonnenen, ovaspezifischen CD4-positiven T-Zellen hinzugefügt werden. Wenn Sie ein anderes Antigen verwenden, ist es wichtig sicherzustellen, dass Sie eine optimale Antigenkonzentration verwenden, um Ihre dendritischen Zellen hier zu pulsieren; OV und LPS werden dem Primärmedium so zugegeben, dass die Endkonzentration von LPS zwei Mikrogramm pro Milliliter in 20 Milliliter und die von Ova hundert Mikrogramm pro Milliliter in 20 Milliliter beträgt.

Hier ist eine Fotografie, die das Aussehen einer typischen Kultur von dendritischen Zellen am Tag 10 zeigt. Auf diesem Bild erkennen Sie, dass die Morphologie sehr typisch für eine antigenpräsentierende Zelle ist. Sie sollten stets den Prozentsatz der CD11c-positiven dendritischen Zellen mittels FACS überprüfen.

Dies dient sicherzustellen, dass Sie eine relativ reine Kultur von dendritischen Zellen für die Verwendung in Ihren Experimenten haben. Hier verwenden wir die Inky-Site von SEN Instruments, um die Aktivierung von dendritischen Zellen zu überwachen, die am Tag 10 mit LPS behandelt und mit Antigen beladen wurden. Dieses Video umfasst einen Zeitraum von 24 Stunden unmittelbar nach der Zugabe von LPS sowie Val und Peptid, und darin werden die dendritischen Zellen aktiver und zeigen einige offensichtliche morphologische Veränderungen.

Nachdem Ihre dendritischen Zellen in der Antigen-Puls-Phase aktiviert wurden, können Sie diese erneut durch Inkubation mit 300 Millimolar EDTA sammeln und die Platte waschen. Zentrifugieren Sie nun Ihre Zellen, waschen Sie sie zweimal mit 50 ml RPMI-Medium, um überschüssiges Antigen zu entfernen, und markieren Sie sie mit dem geeigneten Zelltracer-Farbstoff. In diesem Experiment werde ich die Zellen im inguinalen Lymphknoten abbilden.

Wir müssen zwei bis fünf Millionen dendritische Zellen dermisch in die Flanke der hier gezeigten Maus injizieren. Anschließend lassen wir 24 Stunden verstreichen, damit die dendritischen Zellen zum trainierenden Lymphknoten wandern können. In diesem Video sind die dendritischen Zellen mit CMF zwei hc, einem blauen Zelltracerfarbstoff, markiert.

Sie können die dendritischen Zellen beobachten, die mit markierten T-Zellen interagieren, die antigenspezifisch für Volin sind. Diese T-Zellen sind mit CCF SE markiert. Sie können auch C-M-T-M-R oder einen anderen der zellulären Farbstoffe für molekulare Sonden verwenden. Dies ist das frühe Aktivierungsstadium von T-Zellen, die mit DCs interagieren.

Da sie antigenspezifisch sind, können Sie erkennen, dass die T-Zellen an den Fortsätzen der blau markierten DCs haften. Damit schließen wir unseren Protokollteil ab, der die Herstellung und Anwendung von dendritischen Zellen aus murinem Knochenmark in einem Zwei-Photonen-Bildgebungsversuch demonstriert. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren eigenen Experimenten.