Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Sea elegance ist aufgrund des umfangreichen Wissens über seine Zelllinien sowie der Fülle an Informationen, die aus der Sequenzierung und Analyse seines gesamten Genoms gewonnen wurden, ein äußerst nützlicher Modellorganismus. In diesem Video demonstrieren wir das Verfahren zum Mikroinjizieren von Plasmiden in Sea elegance und die Selektion transgener Nachkommen mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie. Als durchsichtiges, vielzelliges Tier eignet sich Sea elegance ideal dafür, Transgene, die fluoreszenzmarkierte Proteine exprimieren, in vivo sichtbar zu machen. Hallo, mein Name ist Laura Berkowitz und ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin im Caldwell-Labor der Abteilung für Biowissenschaften hier an der University of Alabama.

Und ich bin Adam Knight, ebenfalls aus dem Calwell-Labor an der University of Alabama. Heute zeige ich Ihnen, wie man die Plasmin-Mikroinjektion vorbereitet und durchführt, um transgene Sea Elegance zu erzeugen, und ich zeige Ihnen, wie man transgene Seal Elegance-Linien auswählt und pflegt. Beginnen wir also.

Bevor wir mit der Mikroinjektion beginnen, gibt es einige Vorbereitungsschritte, die ich Ihnen nun zeigen werde. Bereiten Sie zunächst die zu injizierende Plasmid-DNA vor; zwei Plasmide werden benötigt: eines, das die gewebespezifische Expression unseres Gens der Interesse kodiert, und ein zweites, das einen selektierbaren Transformationsmarker bereitstellt. Mischen Sie die Plasmide im Verhältnis eins zu eins, jeweils mit einer Konzentration von 50 Nanogramm pro Mikroliter.

Bereiten Sie als Nächstes Bohrerpads vor, die zum Immobilisieren der Würmer für die Injektion verwendet werden. Legen Sie dazu mehrere 22 mal 50 Millimeter große Deckgläser auf die Laborbank. Geben Sie mit einer Pasteurpipette einen Tropfen geschmolzenes 2 % Agarose auf ein Deckglas und setzen Sie sofort ein zweites Deckglas im 90-Grad-Winkel zum ersten darauf.

Lassen Sie das Aero einige Sekunden lang erstarren und entfernen Sie dann die obere Abdeckungsscheibe. Der Durchmesser der abgeflachten Aero-Scheibe sollte zwischen 15 und 20 Millimetern liegen. Lassen Sie das Pad wie bei einem Haustier mehrere Stunden oder über Nacht vollständig an der Luft trocknen.

Nachdem sie trocken sind, bewahren Sie die Pads in einer Deckglasbox bei Raumtemperatur auf. Bereiten Sie anschließend die Nadel-Lader für die DNA-Lösung vor. Nehmen Sie dazu ein hundert Mikroliter fassendes Kapillarrohr, erhitzen es in der Mitte einer offenen Flamme und ziehen es rasch auf etwa die doppelte Länge.

Nachdem die Kapillare abgekühlt ist, brechen Sie die beiden Hälften auseinander. Stapeln Sie 10 bis 20 Nadellader für die Injektion. Sie können sie aufrecht in einem Mikrozentrifugenröhrchen aufbewahren.

Brack, seien Sie vorsichtig. Die Nadellader-Spitzen sind sehr scharf. Stellen Sie nun die Mikroinjektionsnadeln her.

Diese Nadeln bestehen aus einem speziellen Kapillarrohr, das einen inneren Glasfaden enthält. Dieser Faden dient als Docht für die DNA-Lösung. Zum Herstellen der Nadeln verwenden wir einen Niki-PP-Acht-30-Polar mit einer Heizeinstellung von 24,8; dabei werden mehrere Nadeln gleichzeitig zum Lagern gezogen.

Mehrere Nadeln können auf einem Streifen Modellierknete befestigt werden. Kleine Splitter von Deckgläsern werden verwendet, um die gezogene Nadelspitze zu öffnen. Diese Splitter werden hergestellt, indem ein 18 mal 18 Millimeter großes Deckglas in ein Kim-Tuch eingewickelt und vorsichtig unter Druck gesetzt wird, bis es in mehrere Stücke zerbricht.

Verwenden Sie Splitter, die etwa drei mal vier Millimeter groß sind. Neben der Vorbereitung der DNA und der Nadeln bereiten Sie etwa 50 bis 100 korrekt gestufte Exemplare vor. Jeweils zwei Wildtyp-Würmer für jeden Expressionsvektor-Konstrukt, der injiziert werden soll.

Jetzt sind wir bereit, das Mikroinjektionsmikroskop einzurichten. Öffnen Sie zunächst das Hauptventil an dem Heliumtank, der mit dem Mikroinjektionsnadelarm und -halter verbunden ist, um die Einrichtung des Mikroskops zu beginnen. Schließen Sie den Regler, um das Gas in die Leitung eintreten zu lassen.

Wenn der Druck auf 35 PSI gebracht wurde, kann das Gas mit einem Fußpedal abgelassen werden. Als Nächstes wird ein Nadelbestücker in eine Standard-Mundpipettenspitze eingeführt und etwa ein Mikroliter der Plasmidmischung eingetropft. Danach wird der Bestücker vorsichtig vollständig durch die Mikroinjektionsnadel geschoben, bis ein Widerstand spürbar ist.

Drücken Sie die DNA-Lösung vorsichtig durch Blasen aus und entfernen Sie anschließend den Lader. Sobald die DNA geladen ist, setzen Sie die Nadel in den Mikroinjektionsarm ein, wobei Sie darauf achten müssen, sie innerhalb der kleinen, inneren Gummidichtung zu platzieren, und klemmen sie dann am Arm des Manipulators fest. Legen Sie danach ein Deckglas-Bruchstück zum Nadelzerbrechen an eine Kante des Auger-Pads.

Bedecken Sie das Splitterstück sowie die gesamte Oberfläche des Bohrerkissens mit hohlem Kohlenstofföl. Anschließend platzieren Sie das Bohrerkissen auf dem Objekttisch eines invertierten Mikroskops. Sobald das Bohrerkissen positioniert ist, bringen Sie die Nadel mit Hilfe des Forex-Objektivs und der Hellfeldbeleuchtung in die Mitte des Sichtfeldes, senken Sie jedoch noch nicht in das Öl ab.

Positionieren Sie als Nächstes den inneren Rand des Deckgläserstücks in der Mitte und fokussieren Sie darauf. Senken Sie die Nadel in das Öl ab, sodass sie sich in derselben Fokusebene wie das Deckgläserstück befindet. Erhöhen Sie die Vergrößerung, indem Sie zum 40×-Objektiv wechseln, fokussieren Sie erneut auf die Kante des Deckgläserstücks und positionieren Sie die Nadelspitze gegebenenfalls neu.

Jetzt öffnen Sie die Spitze der Injektionsnadel. Bewegen Sie die Nadel vorsichtig gegen die Kante des Deckgläschens, während Sie gleichzeitig über das Fußpedal einen kurzen Gasimpuls zuführen. Die Nadel wird dadurch ausreichend geöffnet.

Wenn kleine Flüssigkeitstropfen am Ende der Nadel entweichen, ist ein zu starker Flüssigkeitsaustritt aufgrund einer zu großen Öffnung unerwünscht, da dies die Tiere töten würde. Sobald die Nadel bereit ist, beginnen wir die Mikroinjektion. Als Nächstes entfernen Sie das Stößelkissen von der Probe, indem Sie die Nadel anheben.

Ändern Sie jedoch nicht die Position der X- oder Y-Achse. Ziehen Sie den Präparatteller vorsichtig unter der Nadel hervor. Entfernen Sie die Bohrermatte und platzieren Sie sie unter ein Stereomikroskop.

Bringen Sie ein Wort auf das Pad unterhalb der Öloberfläche. Wenn sich der Wurm leicht bewegt, streichen Sie vorsichtig darüber, bis er das Bohrerpads berührt; der feuchte Wurm sollte an dem trockenen Agar haften. Setzen Sie das Bohrerpads anschließend schnell wieder auf den Objekttisch zurück und zentrieren Sie den Wurm im Sichtfeld.

Senken Sie die Nadel dann in dieselbe Fokusebene wie den Wurm. Schalten Sie die Filter am invertierten Mikroskop auf Hoffman-Kontrastbeleuchtung um. Dieser Kontrastfilter ermöglicht es, morphologische Details des Wurms sichtbar zu machen.

Verwenden Sie das 40x-Objektiv, um den körnigen sensorischen Bereich der Wurmgonade unterhalb des wabenförmigen Musters der Keimkerne zu fokussieren. Wählen Sie die Gonade, die sich auf der Seite des Wurms befindet, die der Nadel zugewandt ist. Feinjustieren Sie die Position der Nadel, bis auch deren Spitze scharf gestellt ist.

Führen Sie die Nadel vorsichtig in die Mitte der Gonade ein und geben Sie einen kurzen Druckstoß ab, um einen oder zwei Tropfen DNA in den Gonadenarm abzugeben. Bei ausreichender Übung und Geschicklichkeit sollten Sie eine Flüssigkeitswelle beobachten können, die sich über die distale Gonade ausbreitet. So können Sie jedes Mal die Mitte der Gonade treffen.

Beachten Sie, dass es wichtig ist, beim Injizieren eines Wurms schnell zu arbeiten, da er leicht austrocknen kann. Der gesamte Vorgang sollte idealerweise weniger als ein bis zwei Minuten dauern.

Nach Abschluss der Injektion das Bohrerpolster vom Objektträger nehmen und unter ein Stereomikroskop stellen. Einen Mikroliter M-neun-Puffer direkt auf den injizierten Wurm auftragen. Dies kann beinhalten, die Pipettenspitze unter die Oberfläche des Halo-Carb-Öls zu tauchen.

Das Puffermittel sollte den Wurm rehydrieren, wodurch er von der Oberfläche des Aeros-Pads abhebt. Übertragen Sie den Wurm mithilfe eines Wurmpicks auf eine gewöhnliche Platte. Nun übergebe ich die injizierten Würmer an Adam, und er wird uns die Selektion und Pflege transgener Linien zeigen. Die injizierten Würmer werden auf einzelne frische, beimpfte 60-Millimeter-Platten überführt und zur Fortpflanzung freigegeben.

Diese Würmer stellen die P0-Generation dar. Injizierte Tiere werden typischerweise bei 20 Grad Celsius zwei bis drei Tage lang inkubiert, bis die Nachkommen erscheinen. Sobald die Nachkommen auftreten, können wir mit der Selektion transgener Würmer beginnen.

Die F1-Nachkommen werden auf Hinweise auf den transgenen Marker untersucht. In diesem Fall ist der selektierbare Marker fluoreszierend, sodass wir mithilfe eines fluoreszierenden Stereomikroskops screenen können. Jedes fluoreszierende F1-Tier wird einzeln auf eine neue Platte geklont.

Das injizierte P-null-Tier darf unter all seinen F1-Nachkommen nur ein bis fünf fluoreszierende Nachkommen hervorbringen. Lassen Sie die F1-Hermaphroditen zwei bis drei Tage lang bei 20 Grad Celsius sich fortpflanzen, bis die Nachkommen erscheinen. Sobald die F2-Generation bereit ist, wird ebenfalls auf transgene Tiere geachtet. F2-Tiere, die einen transgenen Marker geerbt und exprimiert haben, gelten als stabile Linie.

Jede unabhängige stabile Linie sollte als separate Linie gehalten werden; vermehren Sie jede Linie, indem Sie bei jeder Generation mehrere transgene Tiere auf eine neue Platte übertragen. Dies muss unter Verwendung eines fluoreszierenden Stereomikroskops durchgeführt werden. Falls der selektierbare Marker fluoreszierend ist, um die Variabilität der Genkopienzahl zu kontrollieren, erzeugen Sie pro injiziertem Konstrukt mindestens drei unabhängige stabile Linien.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Expressionsvektor-Konstrukte mikroinjiziert und stabile Linien auswählt. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.