Phasenkontrast und Differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie
6. August 2008
Dieses Protokoll zeigt die Grundlagen und praktische Anwendungen der Phase und Differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie
Die Lichtmikroskopie ist eines der, wenn nicht das wichtigste Hilfsmittel im Bereich der biomedizinischen Forschung. Abhängig von Ihrer Anwendung sind verschiedene Beleuchtungsarten für die Betrachtung von Proben erwünscht. In diesem Video werden zwei optische Verfahren der durchgehenden Lichtbeleuchtung vorgestellt: die Phasenkontrast- und die DIC- oder differentielle Interferenzkontrastmikroskopie.
Hallo, ich bin Victoria San Frolic von der zentralen Einrichtung für optische Bildgebung am University of Texas Health Science Center in San Antonio. Heute zeige ich Ihnen, wie man Proben korrekt mit Phasenkontrast- und differentieller Interferenzkontrastmikroskopie betrachtet. Beginnen wir also.
Die Standard-Hellfeldmikroskopie eignet sich nicht zum Betrachten transparenter und farbloser Proben. Die Phasenkontrastmikroskopie wird häufig verwendet, um Kontrast für transparente, lichtabsorbierende biologische Proben zu erzeugen. Die Technik wurde 1942 von Zürich entdeckt, der für diese Leistung den Nobelpreis erhielt.
Das Phasenkontrastmikroskop ist ein Lichtmikroskop mit Hellfeldbeleuchtung, das um spezielle Phasenkontrastobjektive erweitert wurde, die eine Phasenplatte oder einen Phasenring enthalten, sowie um eine Kondensorblende in Form eines Rings anstelle einer Blendenblende. Der Ring befindet sich gewöhnlich im Kondensorrevolver, und die Größe des Rings muss je nach verwendetem Objektiv ausgewählt werden. Nach der Einstellung der Köhler-Beleuchtung wählen Sie das geeignete Phasenkontrastobjektiv aus und drehen anschließend den entsprechenden Phasenring in die richtige Position im Kondensor.
Nachdem der Objektiv-Phasenring und der Kondensor-Antiring korrekt ausgerichtet und konzentrisch übereinander liegen, können wir die Probe betrachten und die Fokussierung korrekt einstellen. Lassen Sie uns daher veranschaulichen, wie der Phasenkontrast im Mikroskop aussieht. Hier sehen wir einen Ausschnitt aus einem Rattenlebergewebe.
Im Phasenkontrast. Diese Methode verbessert das Erscheinungsbild biologischen Materials, indem der Kontrast von verschiedenen Grautönen hin zu Tönen von Schwarz bis Weiß verändert wird. Sie werden jedoch bemerken, dass die Proben von einem Halo umgeben sind, der feine Strukturen verdeckt.
Dieser Halo ist ein Artefakt der Beleuchtung durch den Phasenring. Wenn wir nun auf Hellfeld umschalten, werden Sie feststellen, dass dieses Präparat sehr schwer zu erkennen ist. Beim Zurückschalten auf Phasenkontrast können wir die Struktur und Form der Zellen im Rattenlebergewebe seit der Einführung in den späten 1960er Jahren deutlich erkennen.
Differenzinterferenzkontrast- oder DIC-Mikroskopie ist in der biomedizinischen Forschung beliebt, da sie hochauflösende Bilder feiner Strukturen erzeugt, indem die kontrastreichen Grenzflächen verstärkt werden; das erzeugte Bild entspricht einem sehr dünnen optischen Schnitt. Tatsächlich hat die Fähigkeit von DIC, optische Schnitte zu erzeugen, sie zu einer nützlichen Methode der durchgehenden Lichtbeleuchtung neben der konfokalen Mikroskopie gemacht. Das DIC-Mikroskop ist ein Hellfeld-Lichtmikroskop, das um die folgenden Elemente erweitert wurde: einen Polarisator zwischen Lichtquelle und Kondensor.
Ein DIC-Strahlteilungsprisma im Kondensor, ein DIC-Strahlkombinationsprisma direkt hinter der Objektivlinse und ein Analysator im Unendlichkeitsraum vor den beiden Blendenebenen. Um die optimale Leistung der DIC-Optik zu erzielen, ist es wichtig, zunächst das Lichtmikroskop für die Köhler-Beleuchtung auszurichten und anschließend die DIC-Elemente in den optischen Strahlengang einzubringen. Das Licht von der Quelle durchläuft einen Polarisator und wird dann durch das erste Prisma geteilt.
Diese gepaarten Strahlen verlaufen nahe beieinander. Wenn beide Strahlen durch dasselbe Material in der Probe gingen, interferieren sie beim erneuten Zusammenführen durch das zweite Prisma nicht miteinander und erscheinen daher grau. An einer Kante einer Struktur hingegen durchläuft einer der beiden Strahlen ein anderes Material als sein Partner und wird dadurch verändert.
Wenn diese Strahlen durch das zweite Prisma wieder zusammengeführt werden, interferieren sie entweder konstruktiv und erzeugen einen hellen Fleck oder destruktiv und erzeugen einen dunklen Fleck. Hier sehen Sie Diatomeen unter DIC-Kontrast. Sie werden feststellen, dass feine Details der Diatomeenstruktur leicht sichtbar sind.
Wenn jedoch die DIC-Optik entfernt wird, verschwinden diese Details. Der Kontrast über das Präparat ist auf der einen Seite hell und auf der anderen dunkler. Dies erzeugt den Eindruck einer Topographie, tatsächlich handelt es sich jedoch um eine Illusion.
Die Richtung des erzeugten Schatteneffekts kann umgekehrt werden, indem der Polarisator durch einen Übergangspunkt zur entgegengesetzten Kontrastart gedreht wird. Wir haben soeben die optischen Modi des Phasenkontrasts und der DIC besprochen. Zur Erinnerung: Der Phasenkontrast verstärkt den Kontrast von Proben von Schwarz bis Weiß und eignet sich zur Betrachtung von farblosen und transparenten Objekten.
DIC erzeugt ebenfalls Kontrast im Präparat. Dies geschieht durch die Erstellung eines hochauflösenden Bildes eines dünnen optischen Schnitts. Das war's also.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg mit Ihrer Mikroskopie.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Grundlagen und praktischen Anwendungen der Phasenkontrast- und der Differentialinterferenzkontrastmikroskopie (DIC). Diese Techniken verbessern die Visualisierung transparenter und farbloser biologischer Proben und sind daher unverzichtbare Werkzeuge in der biomedizinischen Forschung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biomedizinische Forschung
- Mikroskopische Techniken
- Optische Bildgebung
Hintergrund
- Die Lichtmikroskopie ist entscheidend für die Betrachtung biologischer Proben.
- Die Phasenkontrastmikroskopie verbessert den Kontrast bei transparenten Proben.
- Die DIC-Mikroskopie liefert hochauflösende Bilder feiner Strukturen.
- Beide Techniken sind unerlässlich für eine effektive Analyse der Proben.
Zweck der Studie
- Die Anwendung der Phasenkontrast- und DIC-Mikroskopie demonstrieren.
- Die Einrichtung und Ausrichtung der Mikroskopietechniken erklären.
- Die Vorteile dieser Methoden bei der Beobachtung biologischer Materialien hervorheben.
Verwendete Methoden
- Einrichtung der Köhler-Beleuchtung für eine optimale Lichtverteilung.
- Verwendung von Phasenkontrast-Objektiven und Annuli.
- Anwendung der DIC-Optik einschließlich Polarisationseinrichtungen und Strahlteilerprismen.
- Vergleich der Sichtbarkeit von Proben unter verschiedenen Mikroskopietechniken.
Hauptergebnisse
- Die Phasenkontrastmikroskopie macht zelluläre Strukturen in transparenten Proben sichtbar.
- Die Differentialinterferenzkontrastmikroskopie (DIC) verstärkt feine Details und erzeugt einen topografischen Effekt.
- Beide Techniken verbessern die Klarheit biologischer Proben erheblich.
- Artefakte wie Halo-Effekte in der Phasenkontrastmikroskopie werden beschrieben und erklärt.
Schlussfolgerungen
- Die Phasenkontrastmethode eignet sich gut zum Betrachten farbloser und transparenter Präparate.
- Die DIC-Mikroskopie ermöglicht die hochauflösende Abbildung feiner Strukturen.
- Beide Methoden sind wertvoll für die Weiterentwicklung der Forschung in den biologischen Wissenschaften.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Phasenkontrast- und DIC-Mikroskopie ermöglichen die Visualisierung transparenter, nicht lichtabsorbierender biologischer Proben und unterstützen frühe Entdeckungsworkflows, bei denen eine markierungsfreie Bildgebung erforderlich ist. Diese Verfahren tragen zur mechanistischen Entlastung von Risiken bei, indem sie strukturelle Details und funktionelle Morphologie in lebenden Zellen und Geweben ohne Fixierung oder Anfärbung sichtbar machen. Ihre Integration in Entdeckungspipelines erhöht die Zuverlässigkeit der Zielvalidierung, da die direkte Beobachtung von phänotypischen Reaktionen und der zellulären Architektur unter nahezu physiologischen Bedingungen ermöglicht wird.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die markierungsfreie Beobachtung transparenter Proben wie lebender Zellen und Gewebeschnitte zur Beurteilung morphologischer Veränderungen, die mit der Modulation eines Zielmoleküls assoziiert sind.
- Operativer Wert: Unterstützt die schnelle Untersuchung zellulärer Phänotypen, ohne dass fluoreszierende Markierungen oder chemische Fixierung erforderlich sind, und verkürzt so die Vorbereitungszeit des Assays.
- Prädiktiver Wert: Steigert das Vertrauen in Hypothesen bezüglich eines Zielmoleküls, indem die direkte Visualisierung struktureller und funktioneller Phänotypen in krankheitsrelevanten Systemen ermöglicht wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine kontrastreiche, markierungsfreie Bildgebung, die sich zur Entwicklung phänotypischer Assays eignet, bei denen Transparenz Details in Hellfeldaufnahmen verschleiert.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Standardisierung von Bildgebungsbedingungen durch Köhler-Beleuchtung und präzise Ausrichtung von Phasenplatten oder DIC-Prismen und verbessert so die Reproduzierbarkeit zwischen Durchgängen.
- Skalierbarkeit: Bei Integration in automatisierte Mikroskopiesysteme kompatibel mit Mehrfach-Well-Plattenformaten und somit geeignet für Screening-Kampagnen mit mittlerer Durchsatzleistung.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckungs- und präklinische Phase, indem sie eine konsistente Bildgebung von Primärzellen, Explantaten und Embryomodellen über verschiedene Arbeitsabläufe hinweg ermöglicht.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Ermöglicht die Aufklärung feiner struktureller Details an Gewebegrenzflächen und trägt so zum Verständnis der Wirkmechanismen in komplexen biologischen Systemen bei.
- Krankheitsrelevante Systeme: Anwendbar auf dicke Proben wie Gewebeschnitte, Eier und Embryonen und unterstützt damit die Untersuchung in physiologisch komplexen Modellen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Phasenkontrast- und DIC-Mikroskopie fungieren als Schlüsseltechnologien im Entdeckungsprozess und unterstützen die Hypothesenprüfung in der frühen Biologie, die Assay-Eignung in der Screening-Phase sowie die morphologische Analyse in der translationsmedizinischen Forschung.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung durch direkte Beobachtung zellulärer Reaktionen auf Störungen in transparenten, ungefärbten Proben.
- Screening: Unterstützt die Assay-Entwicklung durch reproduzierbare, kontrastreiche Abbildung von markierungsfreien Proben und verringert so die Variabilität bei phänotypischen Messungen.
- Analysen: Erzeugt quantitative Messungen von Intensität und Kontrast an strukturellen Grenzflächen und ermöglicht damit einen objektiven Vergleich experimenteller Bedingungen.
- Translationale Forschung: Stellt Kontinuität sicher, indem eine konsistente Visualisierung von Primärproben und Explantaten von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung gewährleistet wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine wiederverwendbare Bildgebungsfunktion über Abteilungsgrenzen hinweg dar und reduziert so die Redundanz bei der Zuweisung von Mikroskopie-Ressourcen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanische Unklarheiten, indem feine strukturelle Details und topologische Merkmale in lebenden, ungefärbten Proben sichtbar gemacht werden.
- Operativer Wert: Fördert die Standardisierung durch definierte Ausrichtverfahren für Phasenringe und DIC-Optik, wodurch die tägliche Reproduzierbarkeit verbessert wird.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem das Vertrauen in phänotypische Beobachtungen gestärkt wird, wodurch späte Ausscheidungen aufgrund unerwarteter biologischer Komplexität reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf direkten, markierungsfreien phänotypischen Befunden aus krankheitsrelevanten Systemen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der optischen Ausrichtung, einschließlich der Köhler-Beleuchtung und der präzisen Zentrierung von Phasenplatten oder DIC-Prismen.
- Benötigt spezialisierte Hardware: Phasenkontrast-Objektive mit Phasenringen, Kondensorblenden, Polarisatoren, Strahlteilungs- und Strahlkombinationsprismen sowie Analysatoren.
- Erfordert die Standardisierung von Beleuchtungs- und Ausrichtungsprotokollen über Teamgrenzen hinweg, um konsistente Ergebnisse zwischen verschiedenen Anwendern und Standorten sicherzustellen.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind die Anpassung des Brechungsindex und die Probendicke, die die Qualität der DIC-Schichtung sowie die Entstehung von Halo-Artefakten im Phasenkontrast beeinflussen.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören Halo-Artefakte im Phasenkontrast, die feine Strukturen verdecken können, sowie der gerichtete Schatteneffekt in der DIC, der eine optische Täuschung darstellt und keine echte Topographie wiedergibt.
