Pressure-Polieren Pipetten für verbesserte Patch-Clamp Recording
22. Oktober 2008
Dies ist eine Anleitung zum Ändern der Form von Glas-Mikropipetten. Insbesondere durch Anwendung von Wärme und Luftdruck der Verjüngung ist ohne Erhöhung des Bahnöffnung verbreitert, was zu niedrigeren Pipette Widerstand. Dies ist entscheidend für rauscharme Aufnahmen von kleinen Zellen zu erhalten, sondern ist in vielen Anwendungen.
Dieses Verfahren beginnt damit, dass die Pipettenspitze bei 100-facher Vergrößerung in der Nähe des Polierfadens positioniert wird. Anschließend schalten Sie den Luftdruck und die Heizung ein. Der Faden.
Die Pipettenspitze wird sich ausdehnen und eine stumpfe Form annehmen. Schalten Sie die Hitze aus, um eine kleinere Öffnung der Spitze zu erhalten. Schalten Sie erneut Druck und Hitze aus.
Hallo, ich bin Brandon Johnson aus dem Labor von Dr. Miriam Goodman am Department für Molekulare und Zelluläre Physiologie der Stanford University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zum druckgesteuerten Polieren von Patch-Pipetten. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Ionenkanäle und Membranabschnitte in Neuronen von C. elegans zu untersuchen.
Beginnen wir also. Ziehen Sie einen Satz von sechs bis zehn Patch-Pipetten. Konsultieren Sie einen lokalen Experten oder unser visualisiertes Experiment zum Herstellen von Patch-Pipetten und feinen Elektroden mit einem programmierbaren Polarisator, um Unterstützung zu erhalten.
Um das Verfahren zu beginnen, stellen Sie den Druck der Druckluftleitung auf etwa 40 PS.I ein. Schließen Sie dann die Druckluftleitung an ein Vierwege-Steuerungsventil an. Verbinden Sie ein Stück Plastikschlauch mit dem Vierwegeventil und befestigen Sie einen Hochdruck-Pipettenhalter an dem freien Ende des Plastikschlauchs. Verwenden Sie eine Mikroschweißvorrichtung, um das Polieren durchzuführen.
Wir verwenden das Ccpm-Zwei-Kit von LA Scientific. Diese Apparatur verfügt über einen Hochdruck-Pipettenhalter, ein mit einem Fußpedal gesteuertes Platin-Heizfilament und ein Mikroskop, das mit einer niedrigen und hohen Vergrößerung ausgestattet ist: 10-fach und 100-fach lang. Luftobjektive mit großer Arbeitsdistanz sind ideal, da es entscheidend ist, die Pipettenspitze während des Protokolls beobachten zu können.
Überprüfen Sie anschließend, ob sich das Druckventil in der Aus-Position befindet. Setzen Sie dann eine Pipette in die Pipettenhalterung ein und ziehen Sie die Verbindung per Hand fest, um die Sicherheit im Labor zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass die Pipette fest in der Pipettenhalterung sitzt.
Andernfalls führt der Luftdruck dazu, dass die Pipette aus dem Halter herausgeschleudert wird. Optional können Sie die Pipette mit einem hydrophoben Isolator wie Wachs beschichten, um die Kapazität zu verringern und die Rauschunterdrückung zu verbessern. Bringen Sie nun die Pipette im Halter in der Mikroschleifvorrichtung an, indem Sie den Pipettenhalter auf dem Mikroskoptisch so positionieren, dass sowohl die Spitze als auch das Polierfilament bei einer 10-fachen Vergrößerung auf der Mikroschleifvorrichtung sichtbar sind.
Bringen Sie die Spitze auf etwa 50 Mikrometer an das Filament heran, dann wechseln Sie zum Hochleistungs-Objektiv mit 100-facher Vergrößerung; sowohl die Pipettenspitze als auch das Polierfilament sollten scharf und im Sichtfeld sein. Falls nicht, stellen Sie die Höhe des Filaments nach. Da die Pipettenposition nicht justiert werden kann, sollten sich die Pipettenspitze und das Filament auf entgegengesetzten Seiten des Sichtfelds befinden.
Vermeiden Sie es, die Pipettenspitze zu nahe an das Heizelement zu positionieren, da dieses sich beim Erhitzen ausdehnt und mit der Pipette kollidieren könnte. Sobald die Spitze und das Heizelement korrekt positioniert sind, drehen Sie das Ventil, um Druckluft in die Pipette zu leiten, und erhitzen Sie die Pipettenspitze, bis sich der Bereich hinter der Spitze zu einem ballonartigen Ausbuchtung nach außen hin aufbläht. Beenden Sie das Erhitzen, bevor sich die Spitze zu stark aufbläht.
Es ist erforderlich, Experimente durchzuführen, um den geeigneten Abstand, die Hitze und die Zeit für die gewünschte Form zu bestimmen. Optional kann die Spitze zudem ohne Druck poliert werden, um den Durchmesser der Öffnung an der Spitze zu verringern. Beachten Sie außerdem, dass diese Polierschritte wiederholt werden können, um eine Feinabstimmung vorzunehmen.
Passen Sie sowohl die Form als auch die Abmessungen der Pipettenspitze an. Wenn die Polierung abgeschlossen ist, schalten Sie den Druck ab und richten Sie die Pipettenspitze in eine sichere Richtung.
Entfernen Sie die Pipette und stellen Sie sie in eine saubere Aufbewahrungsbox, in der sie vor Staub geschützt ist. Aus Sicherheitsgründen im Labor vergewissern Sie sich, dass der Druck abgeschaltet ist, bevor Sie die Pipette entfernen. Andernfalls kann sie aus dem Pipettenhalter herausgeschleudert werden.
Nach der Entfernung haben wir Ihnen soeben gezeigt, wie man Pipetten durch Druckpolieren bearbeitet, um verbesserte Aufzeichnungen mittels der Patch-Clamp-Technik zu erzielen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Polierspule mit Glas hoher Schmelztemperatur zu beschichten, um die Ablagerung verdampften Metalls auf den Pipetten zu minimieren, und Vorsicht walten zu lassen, während die Pipetten Druckluft ausgesetzt sind.
Stellen Sie sicher, dass die Pipette fest im Halter sitzt, und schalten Sie die Luft ab, bevor Sie die Pipette aus dem Halter entfernen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen.
Viel Erfolg beim Druckpolieren und viel Glück mit Ihren Experimenten.
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Übersicht
Dieser Leitfaden beschreibt die Modifikation der Form von Glas-Mikropipetten mithilfe von Wärme und Luftdruck. Das Verfahren ermöglicht eine Verbreiterung der Abschrägung, ohne die Öffnung der Spitze zu vergrößern, was für die Erzielung von geräuscharmen Aufnahmen bei Anwendungen an kleinen Zellen unerlässlich ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- Mikropipetten-Herstellung
Hintergrund
- Glasmikropipetten sind entscheidende Werkzeuge in elektrophysiologischen Ableitungen.
- Ein niedrigerer Pipettenwiderstand ist für Aufzeichnungen hoher Qualität erforderlich.
- Die Modifikation der Form kann die Leistungsfähigkeit für verschiedene Anwendungen verbessern.
- Diese Technik ist besonders vorteilhaft für die Ableitung an kleinen Zellen.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Formung von Glas-Mikropipetten bereitstellen.
- Den Pipettenwiderstand verringern, ohne die Tippöffnung zu vergrößern.
- Die Qualität der Ableitungen von kleinen Zellen verbessern.
Verwendete Methoden
- Positionieren der Pipettenspitze in der Nähe eines Polierfadens bei hoher Vergrößerung.
- Anlegen von Luftdruck und Wärme, um die Pipettenspitze zu erweitern.
- Ausschalten der Wärmezufuhr, um eine kleinere Öffnung der Spitze zu erreichen.
- Endgültige Feinabstimmung durch Abschalten von Druck und Wärme.
Hauptergebnisse
- Die Pipettenspitze kann effektiv zu einer stumpfen Form umgeformt werden.
- Ein geringerer Widerstand wird erreicht, ohne die Spitzengröße zu erhöhen.
- Diese Methode verbessert die Aufnahmequalität von kleinen Zellen.
- Zeigt einen praktischen Ansatz für die Modifikation von Mikropipetten.
Schlussfolgerungen
- Die Formung von Glas-Mikropipetten ist eine wertvolle Technik in der Neurowissenschaftsforschung.
- Verbesserte Pipettendesigns führen zu einer besseren Datengüte.
- Diese Methode kann in verschiedenen elektrophysiologischen Studien angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Druckpolieren von Pipetten verringert den elektrischen Widerstand bei Patch-Clamp-Aufnahmen, ohne den Nadeldurchmesser zu verändern, und ermöglicht somit Messungen von Ionenkanälen mit höherer Genauigkeit an kleinen neuronalen Populationen. Diese technische Verbesserung unterstützt die Zielvalidierung in der neurowissenschaftlichen Arzneimittelforschung, indem sie die Signal-Rausch-Verhältnisse in elektrophysiologischen Assays verbessert. Eine verbesserte Aufnahmequalität erhöht die Vorhersagesicherheit in frühen mechanistischen Studien zur neuronalen Erregbarkeit und synaptischen Funktion.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Ionenkanalfunktion in Neuronen mit kleinem Durchmesser, die für neuropathische Schmerzen und Epilepsie-Ziele von entscheidender Bedeutung sind.
- Operativer Wert: Verringert die Variabilität bei Einzelkanalaufnahmen, indem pipettenbedingtes Rauschen minimiert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte Pipettengeometrien für reproduzierbare elektrophysiologische Screening-Panels.
- Operationaler Wert: Kompatibel mit sowohl weichen als auch harten Glas-Mikropipetten, was eine flexible Assay-Entwicklung über verschiedene Zielklassen hinweg ermöglicht.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt Perforated-Patch-Clamp-Anwendungen, indem stumpfe Spitzen erzeugt werden, die die Bildung von Membran-Blebs für antibiotische Perforatoren erhöhen.
- Operativer Wert: Verlängert die Aufzeichnungsdauer in primären neuronalen Kulturen und verbessert so den Durchsatz für Studien zur Optimierung von Wirkstoffkandidaten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in frühe Entdeckungsworkflows ein, in denen die elektrophysiologische Phänotypisierung die Zielwahl und das Profiling von Leitverbindungen unterstützt.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Ionenkanal-Targets in krankheitsrelevanten neuronalen Modellen.
- Screening: Bietet pipetten mit geringem Widerstand für hochpräzise Wirkstoffscreenings in Patch-Clamp-Plattformen.
- Analytik: Erzeugt quantitative Strom- und Leitfähigkeitsmessungen mit verbesserter Signalstabilität.
- Translationale Forschung: Ermöglicht Langzeit-Aufzeichnungen in akuten Schnitten und kultivierten Neuronen zur Modellierung von pharmakokinetisch-pharmakodynamischen Zusammenhängen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Erfordert lediglich ein Upgrade durch einen Mikroschmelzofen und stellt somit eine skalierbare, kostengünstige Verbesserung der bestehenden Elektrophysiologie-Infrastruktur dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung durch sauberere elektrophysiologische Phänotypen.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit von Assays zwischen verschiedenen Standorten und Bedienern durch die Standardisierung der Pipettengeometrie.
- Strategischer Wert: Verringert falsch-negative Ergebnisse bei der Ionenkanalscreening, indem technisches Rauschen minimiert wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen in präklinischen Programmen, die auf die neuronale Erregbarkeit abzielen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Mikropipetten und der Elektrophysiologie.
- Benötigt einen Mikroschleifer mit Hochdruckventil, Heizfaden und vergrößernden Optiken.
- Setzt eine Standardisierung der Druck-, Heiz- und Zeitparameter über verschiedene Anwender hinweg voraus.
- Muss Unterschiede in der Glasart (Natronkalk- vs. Borosilikatglas) hinsichtlich der Polierempfindlichkeit berücksichtigen.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit manueller Spitzenpositionierung und die Abhängigkeit von der Geschicklichkeit des Bedieners, um eine Überdehnung zu vermeiden.
