Machen Patch-Pipetten und Sharp Elektroden mit einem programmierbaren Puller

Glaskapillarpipetten haben sich in Laboren für eine Vielzahl von Techniken durchgesetzt, wie beispielsweise Einzelzell-Elektroporation, DNA-Mikroinjektion und Patch-Clamp-Elektrophysiologie. Um Glaskapillar-Patch-Clamp-Elektroden für Ableitungen vorzubereiten, wird Silikatglas auf einem programmierbaren Puller gezogen. Die Elektrodenspitzen werden mit Wachs beschichtet, anschließend werden die Spitzen abgeflammt und zur späteren Verwendung gelagert. Hallo, ich bin Miriam Goodman vom Department für Molekulare und Zelluläre Physiologie der Stanford University.

In diesem Video zeige ich Ihnen, wie man Patch-Clamp-Pipetten und scharfe Elektroden für die Elektrophysiologie herstellt. Glasmikroelektroden, auch Pipetten genannt, sind seit Jahrzehnten eine Schlüsseltechnologie in der Elektrophysiologie. Heute werden diese Pipetten aus Glas-Kapillaren mithilfe eines programmierbaren Ziehgeräts hergestellt.

Beginnen wir. Um Patch-Clamp-Pipetten herzustellen, verwenden wir saubere und staubfreie Kapillaren aus Sutter Bor-Silikatglas und den Sutter P-97 Flammenschleif-Mikroelektrodenzieher. Das Pipetten-Kochbuch von Sutter ist eine hervorragende Referenz zur Entwicklung geeigneter Ziehprogramme.

Heben Sie zunächst die Staubschutzabdeckung des Pullers an. Nehmen Sie dann eine Glas-Kapillare aus der Box. Achten Sie darauf, den Deckel wieder zu schließen, um die Ansammlung von Staub zu minimieren.

Danach mit einer Hand das Kapillarröhrchen in die Nut auf einer Seite des Filaments schieben und die Klemme leicht anziehen. Zu diesem Zeitpunkt sollte die Klemme fest genug sein, um ein Herunterfallen des Röhrchens zu verhindern, aber noch locker genug, um es in die Nut schieben zu können. Nun die Federmetallsperrung auf derselben Seite lösen.

Dann greifen Sie mit Daumen und Zeigefinger die Metalllaschen, die an der Unterseite beider Träger befestigt sind. Lösen Sie die andere federnde Metallsperrung. Ziehen Sie die Träger so weit wie möglich zusammen und halten Sie sie mit einer Hand an Ort und Stelle.

Danach schieben Sie das Rohr durch das Filamentgehäuse in die Nut des Trägers auf der anderen Seite. Vermeiden Sie es, das Glas in das Heizfilament zu drücken. Ziehen Sie die Klemmen auf beiden Seiten fest.

Sie sollten fest genug sein, um die Träger an ihrem Platz zu halten, aber nicht so fest, dass das Glas zerbricht. Schließen Sie nun die Staubschutzabdeckung und drücken Sie die grüne Taste. Markierte Pol-Pipetten für Patch-Clamp-Aufnahmen werden mithilfe eines Fünf-Schritt-Ziehprogramms hergestellt, bei dem in jedem Schritt die Hitze und Geschwindigkeit abnimmt und im letzten Schritt eine kleine Spitze entsteht.

Dieses Programm nutzt Wärme und Schwerkraft. Das Verfahren zur Herstellung scharfer Elektroden ist dem sehr ähnlich, allerdings verwenden wir in diesem Fall die dünne Glaskapillare von Warner Instruments mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter und einem Innendurchmesser von 0,78 Millimetern. Außerdem wenden wir ein Ziehprogramm an, das zusätzlich zu Wärme und Schwerkraft einen Motor verwendet, sobald die Ziehprogramme abgeschlossen sind.

Heben Sie die Staubschutzabdeckung an, lösen Sie beide Klemmen und nehmen Sie die fertige Pipette heraus. Legen Sie die Pipetten dann in eine Arbeitsbox. Die Box kann hergestellt werden, indem man einen Streifen Schaumstoff auf das Gestell einer Kunststoff-Pipettenspitzenbox klebt und anschließend sechs bis acht Schlitze in den Schaumstoff schneidet.

Setzen Sie die Pipetten in die Schlitze ein. Sobald die Box voll mit gezogenen Pipetten ist, fahren Sie mit dem Schritt des Feinschliffes fort, um die Pipetten abzuschmelzen. Richten Sie vor Beginn des Abgeschmelzens eine Mikroschweißvorrichtung mit einem platinglühenden Heizfaden ein, der über ein Fußpedal gesteuert wird.

Beschichten Sie zunächst die Pipette mit Zahnlack, um die Kapazität zu verringern und die Rauscheigenschaften zu verbessern. Halten Sie hierzu eine kleine Menge geschmolzenen Lackes in der Nähe bereit. Üben Sie Luftdruck auf das hintere Ende der Pipette aus, damit der Lack nicht in die Spitze eindringt.

Tauchen Sie die Spitze dann kurz in die flüssige Wachssubstanz ein und nehmen Sie sie anschließend heraus. Stellen Sie die Pipette in die Poliervorrichtung und bringen Sie die Spitze auf etwa 50 Mikrometer an den Glühdraht heran.

Beachten Sie, dass sich der Glühfaden beim Erhitzen ausdehnt. Geben Sie einen kurzen Hitzepuls von ein oder zwei Sekunden ab, um das Wachs von der Pipettenspitze zu entfernen und das Glas zu glätten. Untersuchen Sie die Pipettenspitzen unter dem Mikroskop, um Durchmesser und Glätte der Öffnung zu bestimmen.

Für Standard-Patch-Clamp-Aufnahmen sollten die Spitzenöffnungen einen Durchmesser von ein bis drei Mikrometern haben; verwerfen Sie Spitzen, die rau, uneben oder unregelmäßig sind. Stellen Sie die fertige Pipette in eine Arbeitsbox und achten Sie darauf, den Deckel zu schließen, um die Pipetten vor Staub zu schützen. Wiederholen Sie dies für 10 erfolgreiche Pipetten. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man Patch-Clamp-Pipetten und scharfe Elektroden mit einem programmierbaren Ziehgerät herstellt.

Dasselbe Verfahren kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Glaswerkzeugen herzustellen, einschließlich Injektionsnadeln für optimale Patch-Clamp-Ergebnisse. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, am selben Tag des Experiments neue, staubfreie Pipetten zu ziehen und sie innerhalb einer Stunde vor dem Experiment zu polieren. Überprüfen Sie außerdem durch visuelle Inspektion, ob die Pipetten glatt und poliert sind.

Sehen Sie sich unbedingt unser anderes Video an, in dem gezeigt wird, wie man Patch-Clamp-Aufnahmen von in Oocyten exprimierten Ionenkanälen durchführt. Gut, das war's. Jetzt sind Sie ein Pipettierexperte – viel Erfolg bei Ihren Experimenten.