Los métodos electrofisiológicos para la grabación de los potenciales sinápticos de la UNM de larvas de Drosophila
6 de febrero de 2009
A continuación se describen los métodos electrofisiológicos para la medición de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular de larvas de Drosophila. Liberación evocada se inicia artificialmente mediante la estimulación de los axones de la neurona motora, y la transmisión a través de la UNM se puede medir por la respuesta postsináptica evocado en el músculo.
Para obtener grabaciones electrofisiológicas estables de las uniones neuromusculares de larvas Joof. Primero, diseque una larva para exponer la pared corporal, los músculos y el sistema nervioso antes de realizar la grabación. Los axones en la base del SNC se cortan posteriormente al ganglio ventral.
Luego se coloca un electrodo de registro sobre el músculo de interés y se coloca un electrodo estimulante cerca de las neuronas motoras inervantes. Los axones seccionados de las neuronas motoras se aspiran hacia la pipeta estimulante. Entonces se pueden registrar los potenciales de unión excitadores.
Hola, soy Wendy MLA del Laboratorio McCabe en el Departamento de Fisiología y Biofísica Celular de la Universidad de Columbia. Hoy les mostraremos un procedimiento para medir la transmisión de tic en la unión neuromuscular de GE lava. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la fisiología sináptica y la neurotransmisión.
Así que comencemos. Para iniciar el experimento, diseque larvas de tercer estadio errantes y en estrella para exponer la pared corporal. Este protocolo se modifica para experimentos electrofisiológicos utilizando alfileres de disección cortos.
Estos tienen entre dos y cuatro milímetros de longitud y tienen menos probabilidades de golpear el objetivo del microscopio en los electrodos durante el experimento. Después de exponer la pared corporal, use pinzas para sostener el SNC y levántelo ligeramente. Luego corte los axones motores de los nervios periféricos y retire el cerebro.
Después de extraer el cerebro, lave la preparación diseccionada dos veces con tampón HL 3.1 con un milimolar de calcio. Ahora que la disección está completa, se pueden realizar grabaciones intracelulares a partir de las células musculares de la larva. Coloque la placa de disección sobre el microscopio de electrofisiología y sumerja la preparación en tampón HL 3.1 con calcio.
Luego fije el electrodo de baño para que esté en contacto con la solución. El electrodo de succión se utiliza para estimular los nervios periféricos que inervan el músculo. Coloque primero el electrodo de succión en el recipiente para evitar vibraciones cuando se coloque el electrodo intracelular sobre el músculo.
Una vez que el electrodo esté en el recipiente, colóquelo cerca de la motoneurona que inerva el músculo seis. En el tercer segmento abdominal, aplique succión suave hasta que el nervio seccionado esté dentro de la pipeta de vidrio. Tenga cuidado de no estirar los nervios al aplicar la succión.
Eleve ligeramente la pipeta para que no toque el músculo. Luego colóquela de manera que no tire de las fibras nerviosas cortadas. Una vez que el electrodo de succión esté en su lugar, posicione el electrodo de registro para las grabaciones intracelulares.
Utilice un microelectrodo afilado lleno con cloruro de potasio tres molar. Coloque el electrodo de registro sobre el centro del músculo seis. Ajuste el desplazamiento de entrada para que marque cero en la solución del baño.
Baje lentamente el electrodo y acérquese al músculo bajo una ampliación óptica alta hasta que toque la superficie muscular. Para confirmar que se ha penetrado el músculo, observe el osciloscopio. El potencial de membrana en reposo debe ser de al menos menos 60 milivoltios.
Deberían observarse ahora potenciales esporádicos en miniatura en la placa motora. Una vez que el electrodo de registro esté en su lugar, deje que las células se estabilicen durante un minuto. Antes de comenzar las grabaciones, utilice un amplificador Axon HS-2 con una etapa de cabezal y un clamp de eje 2B para detectar cambios en el potencial de membrana.
El acoplamiento del eje dos B es la interfaz con una computadora que ejecuta el software P clamp a través del dato digital. 1322 A, que digitaliza la señal. Registre el potencial de membrana en una PC. Con el software clamp X, aplique estímulos al axón motor para generar potenciales de membrana excitatorios o EJP.
Una vez generados los EJP, registre los EJP miniatura durante un período de tres minutos sin estimulación sináptica. Puede utilizarse el software de análisis miniatura para analizar los trazos y determinar la amplitud y frecuencia del EJP miniatura. Para generar los EJP.
Utilice un generador maestro de ocho pulsos para estimular el extremo seccionado de un programa de neurona motora. El generador debe entregar pulsos cuadrados de voltaje de 0,3 milisegundos. Un intervalo de cinco segundos entre estímulos para permitir la recuperación sináptica.
En la JM registre al menos 10 potenciales evocados de cada músculo y promedie las amplitudes. Esta figura muestra un trazo típico registrado del músculo seis de una larva de sal tipo silvestre con respuestas EJP evocadas y mini EJ.PS espontáneas. Acabamos de mostrarle cómo registrar potenciales de acción desde la unión neuromuscular de larvas de drosophila. Al realizar este procedimiento, es importante recordar completar la disección dentro de los tres a diez minutos y comenzar inmediatamente las grabaciones electrofisiológicas mientras las células aún estén sanas y respondan adecuadamente.
Si la disección tarda demasiado, el potencial de membrana en reposo de las células musculares será inferior a menos 60 milivoltios, lo cual es demasiado bajo para registrar. Eso es todo. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este artículo describe métodos electrofisiológicos para medir la transmisión sináptica en la unión neuromuscular (NMJ) de larvas de Drosophila. El proceso implica diseccionar las larvas para exponer la pared corporal y el sistema nervioso, seguido por la colocación de electrodos de registro y estimulación para medir los potenciales de unión excitatorios.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Electrofisiología
- Neurociencia
- Transmisión sináptica
Antecedentes
- Comprender la transmisión sináptica es fundamental para obtener conocimientos sobre la comunicación neural.
- Las larvas de Drosophila sirven como organismo modelo para estudiar la JMNE.
- Las técnicas electrofisiológicas permiten la medición precisa de la actividad sináptica.
- La liberación evocada en la JMNE puede estimularse artificialmente para su análisis.
Objetivo del estudio
- Demostrar métodos para registrar la transmisión sináptica en la JM.
- Proporcionar un protocolo para investigadores interesados en estudios electrofisiológicos.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos de señalización neuromuscular.
Métodos Utilizados
- Diseción de larvas de Drosophila para exponer los músculos y el sistema nervioso.
- Colocación de electrodos de registro en el músculo de interés.
- Uso de electrodos estimulantes cerca de las neuronas motoras.
- Registro de potenciales de unión excitatorios tras la estimulación.
Resultados principales
- Medición exitosa de la transmisión sináptica en la JM.
- Demostración de potenciales de unión excitatorios evocados.
- Validación del enfoque electrofisiológico para el estudio de la JM.
- Conocimientos sobre la dinámica de la señalización sináptica en Drosophila.
Conclusiones
- Los métodos descritos proporcionan un enfoque confiable para estudiar la transmisión en la unión neuromuscular.
- Los registros electrofisiológicos pueden revelar aspectos importantes de la función sináptica.
- Este estudio contribuye al entendimiento más amplio de las interacciones neuromusculares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El registro electrofisiológico en la unión neuromuscular (NMJ) de larvas de Drosophila proporciona una plataforma cuantitativa y genéticamente manipulable para investigar la función sináptica y la neurotransmisión. Este modelo permite la validación fiable de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento, apoyando la evaluación predictiva de la modulación sináptica y de las perturbaciones genéticas. El enfoque es directamente relevante para los equipos de cartera que buscan sistemas robustos y reproducibles para el descubrimiento de fármacos basado en neurobiología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la medición directa de la transmisión sináptica y del contenido cuantal para la validación funcional de objetivos.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al aislar los efectos genéticos o farmacológicos sobre la neurotransmisión.
- Facilita la interrogación basada en hipótesis de las vías sinápticas en un sistema definido y manipulable.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un ensayo estandarizado y reproducible para cuantificar potenciales de unión excitatorios (EJPs) y potenciales de unión excitatorios miniatura (mEJPs).
- Ofrece resultados cuantitativos adecuados para análisis comparativo entre diferentes fondos genéticos o tratamientos con compuestos.
- Permite la preparación de sistemas biológicos validados para flujos de trabajo de cribado posteriores.
Investigación Translacional y Preclínica
- Se alinea con mecanismos sinápticos relevantes para la enfermedad, favoreciendo la continuidad traslacional en programas de neurobiología.
- Apoya el avance ajustado al riesgo al proporcionar datos predictivos sobre la función y modulación sináptica.
- Ofrece un puente desde el descubrimiento genético hasta la validación preclínica en trastornos neuromusculares y sinápticos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método electrofisiológico se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana de objetivos hasta el desarrollo de ensayos y la investigación preclínica, permitiendo pruebas iterativas de hipótesis y evaluación mecanicista.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis nulas y la aclaración de vías al cuantificar las respuestas sinápticas frente a manipulaciones definidas.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles de la amplitud y frecuencia del PJE para un desarrollo sólido de ensayos.
- Análisis: Ofrece datos digitalizados y estadísticamente analizables para comparaciones entre condiciones y entre genotipos.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación con puntos finales sinápticos relevantes para enfermedades, garantizando continuidad preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable y genéticamente flexible para estudios continuos en neurobiología y función sináptica.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos sinápticos.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo electrofisiológicos para lograr reproductibilidad y escalabilidad entre diferentes equipos.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción del proyecto y una selección eficiente del portafolio basada en datos sinápticos cuantitativos.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos centrados en neurobiología.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrofisiología y genética de Drosophila para su ejecución óptima.
- Exige instrumentación especializada, incluyendo microelectrodos, amplificadores y hardware de digitalización.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de disección y registro para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a diversos fondos genéticos y manipulaciones experimentales dentro del sistema Drosophila.
- Limitado al contexto del organismo modelo; la extrapolación traslacional requiere una validación cuidadosa.
