Channelrhodopsin2 estimulación mediada de los potenciales sinápticos en Drosophila Las uniones neuromusculares
16 de marzo de 2009
Este procedimiento utiliza una luz azul activa el canal de las algas y las células específicas de las herramientas de la expresión genética para evocar los potenciales sinápticos con pulsos de luz en la unión neuromuscular (UNM), en Drosophila Larvas. Esta técnica es un barato y fácil de usar alternativas a la estimulación de electrodos de aspiración para los estudios de la fisiología sináptica en laboratorios de investigación y enseñanza.
Este procedimiento comienza con el cultivo de drosófila. Tercer estadio larval con el genotipo adecuado en alimento que contiene todo el trans-retinol. Cada larva se fija por la cabeza y la cola.
Luego, aplanar la preparación. A continuación, se cortan el cerebro y los nervios posteriores para detener la actividad motora rítmica. Después, se ajusta y enfoca la fuente de luz LED azul con su caja de control sobre la preparación.
Finalmente, use un electrodo afilado para empalar el músculo seis. Luego, aplique pulsos de luz con una fuente de voltaje. Hola, soy Nicholas Marstein del laboratorio de la Dra. Leslie Griffith, del Departamento de Biología de la Universidad de Brandeis.
Hola, soy Stefan Pulver, también del Laboratorio Griffith. Hoy les mostraremos el procedimiento para evocar potenciales sinápticos con canal de fuga ausente dos en la unión neuromuscular de larvas de drosófila. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la fisiología sináptica y la drosófila.
También lo utilizamos para enseñar fisiología sináptica y laboratorios docentes. Así que comencemos. Para iniciar este protocolo, mantenga las líneas de moscas UAS channel redsin two y okay, 3 7, 1 gal four en frascos separados que contengan medio estándar para moscas.
Recolecte vírgenes de las líneas de moscas 3 7, 1 gal, cuatro y machos de las líneas UAS channel redsin. Dos líneas. A continuación, prepare un medio para moscas mezclado con retinol todo-trans de un milimolar o a TR. Para ello, derrita el medio estándar para moscas en un microondas durante aproximadamente un minuto.
Una vez fundido, deje que el medio se enfríe durante aproximadamente 30 a 60 segundos, y luego agregue 100 microlitros de 100 milimolar de a TR en etanol al 100% por cada 10 mililitros de medio para moscas. Cuando los frascos que contienen el medio con a TR estén listos, coloque los machos y hembras recolectados en cada frasco. Coloque los frascos en un área oscura a 22-25 grados Celsius para permitir que las moscas se apareen y pongan huevos; espere cuatro o cinco días hasta que las larvas de tercer estadio sean visibles.
En este momento, puede desechar las moscas adultas. Ahora estamos listos para proceder con la configuración del equipo de electrofisiología. Conecte cualquier ocular de microscopio de disección a una fuente de luz LED azul con un disipador de calor.
Utilice un soporte y una abrazadera para fijar una base magnética al ocular y a la fuente de luz LED. Coloque la base magnética sobre la mesa antivibratoria del equipo de electrofisiología. A continuación, conecte la fuente de luz a un circuito de control y luego conecte el circuito de control a una fuente de voltaje externa.
Utilizamos la salida de voltaje del sistema de adquisición de datos de electrofisiología PowerLab fabricado por AD Instruments. Una vez conectado a la fuente de voltaje, aplique pulsos de uno a cinco voltios al circuito de control para activar la luz azul; ajuste la base magnética y la fuente de luz hasta que el haz de luz azul esté enfocado en la zona que ocupará la disección de la larva. Tras realizar los ajustes adecuados, estamos listos para pasar a la disección larval.
Para comenzar con la disección, coloque seis alfileres de 0,1 milímetros en el fondo de un recipiente revestido con Sogar. Retire una larva de tercer estadio del medio de cultivo y colóquela en cualquier placa de Petri de plástico. Enjuague las larvas con solución salina para eliminar cualquier alimento adherido a ellas.
Luego coloque las larvas en el platillo de disección cerca de los alfileres estirados y llene el platillo hasta la mitad con solución salina. Ahora oriente las larvas de manera que pueda ver dos tubos plateados que corren a lo largo de la superficie dorsal del animal. Estos tubos plateados son la tráquea.
Inserte un alfiler grande directamente en la cola, entre los tubos traqueales. Sujete las larvas y coloque un segundo alfiler grande en la cabeza. Asegúrese de estirar el cuerpo longitudinalmente al insertar el alfiler.
Utilice tijeras para hacer una pequeña incisión cerca de la cola. Continúe la incisión a lo largo del cuerpo. Asegúrese de mantener las puntas de las tijeras levantadas para evitar cortar los nervios ventrales y/o los músculos de la pared corporal.
Coloque cuatro alfileres en las cuatro esquinas del animal. Ahora abra la sección media. Inserte los alfileres en el recipiente de disección para filetear al animal.
Fije también la preparación para que se manipule con pinzas y tijeras. Retire los órganos digestivos, la tráquea y los cuerpos grasos del animal. Enjuague la preparación con solución salina.
Después de enjuagar, localice los lóbulos frontales y el ganglio ventral de la preparación utilizando tijeras microquirúrgicas. Corte cuidadosamente a través del ganglio ventral justo detrás de los lóbulos frontales. Una vez completada la disección, proceda con la estimulación con luz azul y la grabación muscular.
Para realizar el registro muscular, prepare un electrodo con una resistencia de 10 a 20 megaohmios. Utilizando un tirador electrónico de electrodos, llene el electrodo preparado con KCl 3 M. Coloque el electrodo lleno en el porta-electrodos.
Ahora coloque la preparación larval bajo un microscopio estereoscópico en el aparato. Ajuste la luz azul de modo que la preparación diseccionada quede centrada en el haz de luz. Identifique el músculo seis o M seis en cualquier segmento de la pared corporal de la larva utilizando un micromanipulador, inserte cuidadosamente el electrodo en el M seis y observe la rápida hiperpolarización del músculo.
Los potenciales de membrana en reposo deben estar entre menos 30 milivoltios y menos 70 milivoltios. Una vez que el electrodo esté correctamente insertado, aplique pulsos de voltaje de 20 a 100 milisegundos al circuito de control. Aumente progresivamente el voltaje suministrado al circuito de control.
Observe los potenciales de unión excitatoria en la célula muscular. A continuación se muestra un resultado representativo que ilustra un potencial de unión excitatoria provocado por pulsos luminosos breves. La amplitud del potencial de unión excitatoria mostrada aquí corresponde a la amplitud sumada de dos neuronas motoras que se sabe que hacen sinapsis.
M seis. Intensidades más bajas o duraciones más cortas de luz pueden revelar el potencial de unión excitatorio de menor amplitud proveniente de una sola neurona motora. Acabamos de mostrarle cómo realizar la estimulación mediada por ausencia de canal, mediante dos vías, de los potenciales sinápticos en la unión neuromuscular del oph.
Al realizar este procedimiento, es importante recordar no dañar la pared corporal de la preparación durante la disección. También es fundamental tener en cuenta que, aunque una preparación pueda estar sobreexcitada inmediatamente después de la disección, con el tiempo se calmará y permitirá grabaciones adecuadas. Al atravesar los músculos, tenga cuidado de no penetrar por debajo de la primera capa muscular hacia la pared corporal.
Cuando el electrodo queda atrapado en la pared corporal, a veces se pueden obtener potenciales hiperpolarizados pero sin estar realmente dentro de una célula muscular. Eso es todo.
Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
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Resumen
Este procedimiento utiliza un canal algal activado por luz azul y herramientas de expresión genética específicas para células con el fin de evocar potenciales sinápticos mediante pulsos de luz en la unión neuromuscular (NMJ) de larvas de Drosophila. Esta técnica es una alternativa económica y de fácil uso frente a la estimulación con electrodos de succión para estudios de fisiología sináptica en laboratorios de investigación y docencia.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Fisiología sináptica
- Expresión genética
Antecedentes
- Las larvas de Drosophila se utilizan comúnmente en investigaciones de neurociencia.
- Los canales activados por la luz proporcionan un método no invasivo para estudiar la actividad sináptica.
- Métodos tradicionales como la estimulación con electrodos de succión pueden ser complejos y costosos.
- Este procedimiento tiene como objetivo simplificar el proceso de evocar potenciales sinápticos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para estudiar la fisiología sináptica mediante estimulación lumínica.
- Proporcionar una alternativa accesible para fines educativos e investigativos.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos sinápticos en la unión neuromuscular (NMJ).
Métodos Utilizados
- Criar larvas de Drosophila en alimento específico.
- Fijar las larvas para prepararlas para la estimulación.
- Seccionar el cerebro y los nervios posteriores para detener la actividad motora.
- Utilizar una fuente de luz LED azul para evocar potenciales sinápticos.
Resultados principales
- Evocación exitosa de potenciales sinápticos mediante pulsos de luz.
- Demuestra la eficacia del canal algal activado por luz azul.
- Validación del método como una alternativa confiable a las técnicas tradicionales.
- Potencial para aplicaciones más amplias en la investigación de la fisiología sináptica.
Conclusiones
- El método activado por luz es eficaz para estudiar la fisiología de la unión neuromuscular.
- Este enfoque puede facilitar la investigación y la enseñanza en neurociencia.
- Estudios futuros podrían explorar aplicaciones adicionales de esta técnica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la estimulación no invasiva basada en luz de la actividad sináptica en un modelo genéticamente accesible, reduciendo las barreras técnicas en los flujos de trabajo de neurofisiología. Facilita la generación de datos reproducibles para la validación de objetivos en fases iniciales del descubrimiento, especialmente en casos donde la manipulación manual de electrodos limita el rendimiento o la eficiencia del entrenamiento. El enfoque mejora la confianza predictiva al proporcionar una alternativa estandarizada y escalable a la estimulación con electrodos de succión en estudios de la unión neuromuscular de Drosophila.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de los mecanismos de transmisión sináptica mediante la activación neuronal precisa controlada por luz.
- Valor operativo: Reduce la dependencia de la manipulación técnicamente exigente de electrodos de succión, mejorando la consistencia del ensayo entre diferentes usuarios.
- Valor estratégico: Facilita la selección fenotípica de alta fidelidad de modificadores genéticos o farmacológicos de la función sináptica.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera potenciales unión excitatorios (EJPs) cuantificables como una medida directa de la eficacia de la transmisión neuromuscular.
- Valor operativo: Permite la estandarización de parámetros de estimulación mediante el control de pulsos con LED azul, mejorando la reproducibilidad entre experimentos.
- Valor estratégico: Facilita la miniaturización del ensayo y su adaptación para la selección de compuestos en ensayos de neurotoxicidad o neuroterapéuticos basados en Drosophila.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad para estudiar vías sinápticas conservadas con acceso genético.
- Valor operativo: Permite el seguimiento longitudinal de fenotipos sinápticos en modelos larvales con variabilidad mínima en la preparación.
- Valor estratégico: Apoya la reducción mecanicista de riesgos de dianas implicadas en la transmisión neuromuscular o en la liberación de neurotransmisores.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano como una modalidad de estimulación para evaluar la función sináptica antes de las etapas de optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Permite probar hipótesis sobre la excitabilidad neuronal y los mecanismos de liberación de vesículas sinápticas mediante pulsos de luz controlados.
- Selección: Proporciona amplitudes estandarizadas y cuantificables de potenciales juntales excitadores adecuadas para evaluar perturbaciones genéticas o químicas.
- Análisis: Genera salidas continuas de trazas de voltaje que permiten analizar la amplitud, el tiempo de ascenso y la frecuencia de los eventos sinápticos.
- Investigación Traducional: Se conecta con mecanismos sinápticos conservados, relevantes para trastornos neuromusculares humanos, mediante ortología genética.
- Reutilización Empresarial: Representa una plataforma de estimulación reutilizable adaptable a múltiples genotipos larvales y condiciones experimentales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del objetivo al reducir la variabilidad de las mediciones debida a artefactos por la colocación de electrodos.
- Valor operativo: Mejora el rendimiento del laboratorio y la eficiencia del entrenamiento en entornos docentes e investigadores mediante una configuración de estimulación simplificada.
- Valor estratégico: Reduce las barreras técnicas para los ensayos de fisiología sináptica, permitiendo un acceso más amplio del equipo y una colaboración interdisciplinaria.
- Impacto en la cartera: Apoya las decisiones de avance o interrupción en la priorización de objetivos al proporcionar lecturas sinápticas fiables y de alta fidelidad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en genética de Drosophila, electrofisiología y sistemas de estimulación óptica.
- Necesita una fuente de luz LED azul, circuito de control de voltaje y un sistema de electrofisiología basado en solución salina.
- Exige la estandarización del suministro de retinal, la clasificación por etapas de las larvas y los protocolos de disección entre diferentes usuarios.
- Limitado a objetivos musculares superficiales debido a las restricciones de penetración de la luz en preparaciones intactas.
- Depende de la expresión funcional de ChR2 y de la disponibilidad del cofactor (retinal todo-trans) en las neuronas motoras.
