Microinyección de ARNm y oligonucleótidos antisentido Morpholino en embriones de pez cebra.

Este procedimiento comienza preparando ARNm con caperuza transcrito in vitro y morfolinos. Se llena una micropipeta aspirando la solución que contiene morfolinos y luego se calibra el volumen de inyección utilizando un micrómetro en embriones en estadio de una sola célula. A continuación, se recolectan embriones de pez cebra y se acomodan en una cámara de microinyección para realizar microinyecciones en el vitelo.

Se inyecta la solución de trabajo en la yema justo debajo de la célula y se aprovechan los movimientos citoplasmáticos para transportar la solución destinada a microinyecciones celulares. Inyecte la solución en el citoplasma celular tras las inyecciones. Incube los embriones a 28,5 grados Celsius en medio E tres y evalúe los fenotipos de interés en las etapas subsiguientes.

Hola, soy Shiloh Yuen del laboratorio, hijo del Dr. Sasha y del Departamento de Genética de la Escuela de Medicina de la Universidad de Yale. Hoy demostraremos una técnica sólida de microinyección para realizar estudios de sobreexpresión de ARNm y de inhibición génica mediante oligonucleótidos morfolinos en pez cebra. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el papel del S cilium en enfermedades renales quísticas.

Así que comencemos. Un enfoque poderoso para estudios de función génica consiste en microinyectar ARN transcrito in vitro y con caperuza en embriones de pez cebra. En esta demostración, microinyectaremos un transcrito marcado con EGFP y utilizaremos la expresión de GFP en embriones enteros vivos como un indicador visible de una inyección exitosa.

Primero, realizaremos una reacción de transcripción in vitro de ARN con caperuza en su transcrito de interés. En nuestro laboratorio, habitualmente insertamos el ADN de interés en un vector PCRII-plus y llevamos a cabo una reacción de síntesis in vitro para obtener grandes cantidades de ARN caperuzado utilizando el kit Mmessage Mmachine SP6. A continuación, purificaremos la muestra de ARN pasándola a través del kit RNeasy Mini o mediante extracción con fenol-cloroformo y precipitación con isopropanol.

Determine cuidadosamente la concentración de la preparación de ARN y almacénela a menos 80 grados Celsius hasta el momento de su uso el día de la inyección. Descongele la muestra de ARN, vortexee suavemente y centrifugue brevemente. A continuación, prepare una solución de trabajo con agua estéril y una concentración final de 0,025 a 0,05 % de rojo de fenol; el rojo de fenol sirve como marcador visible para la inyección de la solución en el embrión.

Aquí prepararemos una solución de trabajo de 100 nanogramos por microlitro de ARNm de EGFP con fenol rojo al 0,05 %. Por último, mantenga la muestra de trabajo en hielo y devuelva el stock de ARN a menos 80 grados Celsius. Pase a la preparación del morfo cuando esté listo para inyectar esta muestra.

Los oligonucleótidos antisentido Morino se utilizan ampliamente para modificar la expresión génica al bloquear la traducción de una proteína diana o al modificar el empalme del ARNm. Los morfolinos en el pez cebra constituyen una herramienta potente de genética inversa al eliminar la función génica. Aquí realizaremos microinyección de un morfolino dirigido al sitio de iniciación de la traducción de pkd2. Rutinariamente utilizamos 300 M de un morfolino, diseñado específicamente para un gen de interés, obtenido de Gene Tools LLC.

A continuación, agregamos 100 microlitros de agua estéril para obtener una solución stock de tres milimolar y luego alícuotamos la solución y la almacenamos a menos 20 grados Celsius hasta el momento de su uso el día de la inyección. Calentamos la solución de morino a 65 grados Celsius durante cinco minutos. Luego enfriamos rápidamente la solución en hielo inmediatamente y centrifugamos brevemente; este paso desnaturaliza cualquier estructura secundaria en el oligonucleótido y asegura que la solución esté completamente solubilizada.

A continuación, prepararemos una solución de trabajo diluyendo la solución Morpho en agua estéril y una concentración final de 0,025 a 0,05 % pinal rojo. En esta demostración, prepararemos una solución de trabajo de 0,5 milimolar PKD dos morino con 0,05 % fenol rojo. Mantenga la solución de trabajo a temperatura ambiente y proceda al llenado de micropipetas cuando esté listo para inyectar esta muestra.

Para comenzar, necesitaremos fabricar micropipetas que se utilizarán para las inyecciones. Esto se realiza calentando y tirando de tubos capilares de vidrio de silicato BOS en un dispositivo polar para micropipetas. Una vez que se han estirado las agujas, se guardan en una placa de Petri sobre una pequeña cantidad de arcilla o cinta adhesiva.

A continuación, prepararemos placas de cámara para microinyección vertiendo agar al 1,5 % en placas de medio XE tres moldeadas con surcos en forma de cuña. Esto servirá como un método sencillo para sostener los embriones durante la inyección. Luego, se deja que las placas de cámara con agar se solidifiquen y se almacenan a cuatro grados Celsius hasta que estén listas para usarse.

Para comenzar a llenar la micropipeta, corte la punta distal con pinzas o una hoja de bisturí quirúrgico para crear una abertura que sea apenas visible bajo un microscopio estereoscópico a 50 aumentos. A continuación, coloque dos microlitros de su solución de trabajo.

Como una gota sobre un portaobjetos, sujete la parte posterior de una micropipeta a una jeringa de cinco mililitros equipada con tubo en una aguja hipodérmica y sumerja ligeramente la punta distal de la micropipeta en su gota de solución de trabajo. Tenga cuidado de no romper la punta de la micropipeta. Aspire la solución de trabajo a través del extremo distal de la micropipeta tirando del émbolo de la jeringa.

A continuación, calibraremos el volumen de inyección de la micropipeta. Coloque una gota de aceite mineral sobre un portaobjetos micrométrico y encienda la fuente de alimentación y el suministro de aire del aparato de microinyección por pulsos de presión. A continuación, conecte la micropipeta al soporte de micropipeta del aparato de microinyección.

El microinyector está regulado por presión y los pulsos se activan presionando el pedal con el pie bajo el microscopio de disección. Pruebe el volumen de inyección utilizando el microinyector para colocar una gota de su solución de trabajo sobre el aceite del micrómetro. Mida el diámetro de la gota mientras flota como una esfera sobre la superficie del aceite.

Ajuste la duración y la presión de la inyección para calibrar cuidadosamente el volumen de inyección. Este paso contribuye a la reproducibilidad del experimento de microinyección. En esta demostración, todas las microinyecciones se realizarán con un diámetro de gota de 0.15 milímetros.

Finalmente, una vez que se haya calibrado el volumen de inyección, utilice el botón de retención en el microinyector para evitar la recarga y la fuga de la micropipeta. Ahora es el momento de preparar los embriones de pez cebra. Los peces cebra se aparearán aleatoriamente durante las primeras horas de cada mañana; para comenzar la preparación, recolecte los embriones en la etapa de una sola célula y colóquelos en medio 1XE3.

Utilizando una pipeta de transferencia de tres mililitros, coloque los embriones a lo largo de las ranuras en forma de cuña en las placas de la cámara de microinyección. Retire el medio de manera que los embriones queden ligeramente sumergidos y no inundados. Este paso facilita que los embriones se asienten en el fondo de las ranuras, así como la penetración del corion por la micropipeta.

Ahora comenzaremos las inyecciones. Primero, manipularemos los embriones con la micropipeta para que el citoplasma del embrión en estadio de una sola célula sea visible bajo el microscopio estereoscópico. Tenga cuidado de no romper la punta de la micropipeta; penetre la coriona y luego el vitelo con la micropipeta para inyectar dentro del embrión.

En esta demostración, primero realizaremos una microinyección en el vitelo directamente debajo de la célula y permitiremos que el citoplasma y la difusión introduzcan la solución de trabajo en la célula. Este flujo es visible debido al rojo de fenol agregado a la solución de trabajo. Dado que se trata de un embrión de una sola célula, puede inyectarse manualmente o con un manipulador.

También demostraremos la inyección directa en el citoplasma celular. La microinyección directa en la célula es más robusta, pero consume más tiempo, ya que se requiere una orientación adecuada del embrión y una técnica precisa de microinyección. Dado que la membrana celular es más resistente que la membrana del vitelo, a menudo es más rápido introducir la micropipeta a través del vitelo para alcanzar la célula.

El citoplasma orientando el polo animal hacia el fondo del canal y trabajar con manos firmes puede ayudar en este método de inyección. Después de la microinyección, coloque los embriones en una placa de Petri con medio E3 e incúbelos a 28,5 grados Celsius para un desarrollo normal. Durante las próximas horas y días del desarrollo embrionario, observe los embriones para detectar los fenotipos de interés.

Para verificar el éxito de la microinyección, monitorearemos la expresión de GFP en los embriones en desarrollo a partir de la etapa de escudo mediante microscopía de fluorescencia en todo el embrión en vivo. La expresión del constructo es más intensa durante los primeros eventos del desarrollo embrionario y a menudo disminuirá durante el desarrollo, ya que el ARN con caperuza inyectado se degrada gradualmente y depende de la estabilidad de la proteína expresada. Con base en resultados previamente publicados, esperamos que la morfina PKD dos imite la curvatura del eje corporal dorsal observada en los peces cebra mutantes PKD dos y presente quistes renales aproximadamente entre dos y tres días después de la fertilización.

Acabamos de mostrarle una técnica de microinyección robusta para realizar estudios de sobreexpresión de ARNm y de inhibición génica mediante oligonucleótidos morfolinos en pez cebra. Al realizar este procedimiento, recuerde que es importante inyectar con mano firme. Eso es todo.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.