Micromanipulación de la expresión génica en el cerebro de pez cebra adulto Uso Microinyección cerebroventricular de oligonucleótidos Morpholino

El objetivo general de este procedimiento es microinyectar oligonucleótidos morfo en el ventrículo cerebral del cerebro del pez cebra adulto y reducir la actividad de los genes en las células radiogliales. Esto se logra anestesiando primero al pez cebra. A continuación, se genera una hendidura en el cráneo, superponiendo el tronco óptico con una aguja dentada de púas.

Luego, la solución morfológica se inyecta a través del sitio de la incisión en el líquido ventricular cerebral. Finalmente, la eficiencia y la precisión de la inyección se verifican bajo el microscopio de fluorescencia. En última instancia, se pueden obtener resultados del bloqueo demasiado eficiente y generalizado de la producción de proteínas de los genes de interés en las células gliales radiales del cerebro del pez cebra adulto a través de la eliminación de genes mediada por morfos, que se puede ensayar mediante cortes histológicos y tinciones inmunohistoquímicas.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los enfoques transgénicos o los métodos de administración basados en electrooperación, es que la CVMI requiere menos tiempo y es más eficiente para dirigirse a toda la población de células radiogliales. Esos genes ajustables y muchos pueden ser derribados al mismo tiempo. Para preparar la mezcla de inyección, comience por hacer una solución madre de Morpho de 500 micromolares.

Usando PBS para 10 inyecciones, prepare 10 microlitros de mezcla de inyección combinando nueve microlitros de solución morfo diluida o sin diluir con un microlitro de un tinte de seguimiento fluorescente. Guárdalo a temperatura ambiente. Utilice un extractor de agujas para preparar los capilares de inyección de vidrio de acuerdo con los siguientes parámetros.

Encienda la fuente de presión y ajuste la configuración de presión a 50 PSI o 3,5 bares. Ajuste la configuración del microinyector de la siguiente manera. Presión de retención: 20 PSI, presión de expulsión, 10 PSI, valor del período: 2,5 y 100 milisegundos.

Rango de compuertas. Encienda el iluminador de anillo y ubique el anillo sobre la platina del microscopio. Coloque el soporte capilar en una posición adecuada junto al microscopio.

Inserte el capilar de vidrio en el soporte y ajuste el ángulo de inyección a 45 grados. Con unas pinzas de búsqueda en el extremo, separe la punta del capilar de vidrio y calibre la salida de presión del orificio. Al sumergir la punta de la aguja en el agua de pescado y aplicar un pulso de presión continuo, las burbujas de aire deben formar una sola fila que indique la presión óptima o el tamaño del orificio.

Cargue el capilar de vidrio con la solución inyectable. Evitando las burbujas de aire, aplique presión para eliminar el aire entre la punta del capilar de vidrio y la solución de inyección cargada. Después de preparar una solución de tallo al 0,1% del meab anestésico, transfiera la cantidad deseada de peces a un recipiente de transporte con agua para peces.

Prepare una solución de trabajo de anestésico mezclando 200 mililitros de agua de pescado con cinco mililitros de solución madre MISP. Llene una placa de Petri hasta la mitad con el anestésico para usarla como inyecciones. Incubar un pez en el anestésico hasta que deje de moverse.

Luego use una red para transferirlo a la placa de Petri del anestésico. Para facilitar la incisión, utilice las pinzas para sujetar suavemente el pez y orientarlo con la cabeza ligeramente inclinada hacia abajo. Con la punta de una aguja de púas de calibre 30, haz una pequeña hendidura en el cráneo sin penetrar demasiado profundamente, ya que esto causará daño al tejido cerebral.

Mientras continúa sosteniendo el pez, inserte la punta del capilar de vidrio a través del sitio de la incisión aproximadamente medio milímetro y, evitando el contacto con el tejido cerebral, oriéntelo hacia el céfalo. Inyecte la solución, debe dispersarse inmediatamente. Transfiera el pescado al agua dulce del pescado y deje que se recupere.

Unos 30 minutos después, vuelva a anestesiar al pez y lo revise bajo un microscopio de fluorescencia para buscar una distribución generalizada del líquido. Basado en fluorescencia roja. Regrese el pez a su tanque y vuelva a ponerlo en circulación.

Hasta su uso para análisis de comportamiento o para preparar muestras de tejido como se ve aquí, una inyección precisa conduce a la dispersión de la solución inyectada por todo el cerebro y a una focalización eficiente de las células cercanas a la superficie ventricular. Sin embargo, en las inyecciones en las que el capilar de vidrio se empala, el tejido cerebral tendrá una señal fluorescente densa en el punto de inyección. Y si la cantidad inyectada no es suficiente, se observará una señal fluorescente débil.

Esta figura demuestra que vivo morphos puede penetrar unos pocos diámetros celulares dentro de la superficie ventricular y, por lo tanto, puede dirigirse de manera eficiente a las células ventriculares en comparación con el control. Morfo. La inyección de morpho contra PCNA reduce eficazmente la expresión génica en las células ventriculares. En estas imágenes de inmunofluorescencia, la tinción inmunológica BRDU y QCD después del experimento de persecución de pulsos A-B-R-D-U demuestra que la eliminación de PCNA con morfosis antisentido conduce a una reducción significativa en las neuronas recién nacidas, lo que sugiere que CVMI se puede usar para eliminar genes endógenos que posteriormente dan lugar a consecuencias funcionales.

Así que después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta de neurogénesis regeneradora del cerebro adulto de los peces.