Visualización de antígeno específico de células T CD4 + con MHC de clase II tetrámeros

Bueno, lo que realmente es único del ensayo Teer es que permite visualizar directamente las células T específicas frente a un antígeno. El te, el teer es el aspecto principal y único de nuestro ensayo. Eso se combina con un paso de amplificación que realizamos.

Sabemos que aislamos los linfocitos T y luego los cultivamos en un entorno que enriquece la muestra con los linfocitos T que nos interesan. Luego, podemos etiquetar específicamente solo esas células y visualizarlas en un citómetro de flujo. Por lo tanto, con ensayos anteriores, como los ensayos con CSFE o de proliferación que existen desde hace décadas, lo que se obtiene es solo una medición global general de lo que está ocurriendo en toda la población de linfocitos T.

Pero tienes millones de linfocitos T en el cuerpo y estos reconocen un conjunto muy diverso de patrones. Si tienes suerte, quizás una de cada 200 000 a 300 000 células de la muestra sea la que estás buscando. Y por eso este ensayo realiza esos pasos de enriquecimiento.

Luego, con un número de prueba, y dado que está teñiendo directamente, en realidad puede visualizar, por encima del fondo, una población que representa menos del 1 % del número total de células. De este modo, puede observar diferencias muy, muy pequeñas y obtener un recuento bastante preciso del número de células T presentes en esa muestra de sangre, es decir, del número de células T en ese individuo que reconocen su patrón de interés. Pero no termina ahí, porque los tetrámeros también le permiten no solo etiquetar esas células T, sino aisladas para su posterior análisis.

¿Y los tetrámeros que utilizan están fabricados aquí en el BRI, es correcto? Sí. Somos uno de los muy pocos laboratorios del país que ha logrado producir tetrámeros de clase dos. Nuestro objetivo es distribuir estos reactivos a costo a cualquier laboratorio interesado en adoptar esta tecnología.

¿Qué aspectos diría que son los más difíciles o desafiantes de este ensayo en cuanto a su replicación en otros laboratorios? Bueno, al pensarlo, hay realmente dos: el crecimiento de las células T. Es algo que en realidad es un poco un arte.

Usted, usted tiene decisiones casi diarias en cuanto a si las células necesitan nutrientes adicionales o más espacio para crecer. Y luego, la segunda parte, que creo que probablemente es la más difícil para un operador inexperto, es en realidad el análisis de datos. Consiste en determinar qué parte de la señal es realmente una respuesta positiva frente a qué parte es simplemente inherente, ya sabe, a la física y la atracción.

Y el hecho de que todo tenga cierto grado de adherencia es algo que, nuevamente, requiere mucha experiencia, especialmente en contextos donde la respuesta general será un poco débil. ¿De qué manera la información que generará con este ensayo tiene el potencial de beneficiar a los pacientes en este momento? Uno de los primeros signos característicos que aparece en cualquier paciente con enfermedad autoinmune es una especie de constelación de anticuerpos específicos para esa enfermedad.

Sabemos por los fundamentos básicos de la inmunología que, dondequiera que haya una respuesta de anticuerpos, siempre hay primero una respuesta de células T. Por lo tanto, si pudiéramos observar en individuos en riesgo ese aumento en la actividad de las células T que precede a la formación de anticuerpos, esto nos ayudaría a definir realmente un nuevo nivel de riesgo o a identificar individuos que están encaminándose hacia la presencia de autoanticuerpos, lo que, con suerte, abriría una ventana para terapias intervencionistas. Este procedimiento purificará y expandirá células T CD4 positivas específicas para antígenos y las visualizará utilizando reactivos y equipos de clase dos de cabinas de seguridad biológica de flujo laminar.

Este será el espacio de trabajo principal para el procedimiento. Tubos cónicos de 50 mililitros, tubo principal para el aislamiento de PBMC, un XPBS. Este debe estar libre de calcio y magnesio, empaque tipo fol, envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la luz, pipeta regulada, pipeta CoStar de 10 mil, envases aerosoles con insertos de 50 mil utilizados para prevenir la contaminación de la centrífuga con sangre.

Pipetas para centrífuga GS six R, pipetas Pasteur, tampón hemolítico que contiene 8,3 gramos por litro de cloruro de amonio, 1,0 gramos por litro de bicarbonato de sodio, 0,04 gramos por litro de EDTA disódico, solución al 0,2% de trian azul en PBS, hemocitómetro, tubo cónico de 15 mililitros, tampón de trabajo que contiene PBS suplementado con dos milimoles de EDTA más cinco gramos por litro.

Kit de aislamiento BSA máx CD cuatro dos adquirido de Milin biotech bloque magnético EP adquirido de stem cell technologies. Otras plataformas de enriquecimiento celular magnético podrían utilizarse con eficacia equivalente. Tubo de polipropileno de cinco mililitros RPMI 1640 suplementado con 25 milimolar hippies utilizado para preparar medio para linfocitos T suero humano agrupado utilizado para suplementar el medio para linfocitos T tira de pen utilizada para suplementar el medio para linfocitos T 500 mililitros filtro estéril de tapón de botella de 0,22 micrones placa estéril de 48 pocillos utilizada para cultivo de expansión in vitro paso incubadora de CO2 a 37 grados solución de 20 miligramos por mililitro de péptido sintético que contiene el epítopo de interés.

Se utilizó un tubo de fax de poliestireno de 5 ml cargado con péptido clase II tétramer para visualizar linfocitos T específicos del antígeno, y se emplearon anticuerpos anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD25 para recubrir los linfocitos T específicos del antígeno. Utilice un citómetro de flujo Fax Calibur o equivalente antes de comenzar el procedimiento. Reúna todos los materiales y equipos en su área de trabajo.

La siguiente demostración abarcará los siguientes pasos. Aislamiento de PBMC, separación de linfocitos T CD4 positivos, cultivo de expansión in vitro y visualización de linfocitos T mediante teem o tinción. Paso uno: aislamiento de PBMC.

Obtenga una muestra de sangre. La sangre debe recolectarse en jeringas o tubos para sangre y anticoagulada con heparina en una proporción de uno a 50 para prevenir la coagulación; espere un rendimiento de aproximadamente 1 millón de PBMC por mililitro de sangre. Aproximadamente el 40 % de estos serán linfocitos T positivos para CD4.

Aliquotar la sangre en tubos cónicos de 50 mililitros. 25 mililitros de sangre por tubo. Mezclar suavemente la sangre antes de que se produzca la coagulación ALI para distribuir el plasma.

Añada PBS hasta alcanzar un volumen total de 40 mililitros y coloque por debajo secando 11 mililitros del vial insertándolo en el tubo de sangre y retirando cuidadosamente la pipeta del pipeteador. El vial se vaciará lentamente hacia el fondo del tubo. Una vez que el nivel se haya igualado, retire lentamente la pipeta del tubo de sangre, deseche la tapa, coloque tapones a los tubos de sangre y colóquelos dentro de los cilindros de aerosol.

Cierre firmemente los recipientes y centrifugue a 900 veces G durante 20 minutos sin frenado. Es fundamental que no se aplique frenado al final de esta centrifugación, ya que la fuerza de frenado perturbaría la capa de células tras la centrifugación. Los PBMC deben formar una capa blanca bien definida entre el plasma amarillo superior y el Fial transparente inferior.

Retire suavemente la capa de glóbulos blancos utilizando una pipeta de transferencia y transfiérala a un nuevo tubo. Alguno de plasma y fial pueden aspirarse junto con los pbmc, pero evite aspirar cualquier parte de la capa de glóbulos rojos. Típicamente, en este paso se pueden combinar dos tubos de sangre en un solo tubo celular.

Para aumentar el tamaño del precipitado, agregue PBS hasta alcanzar un volumen total de 15 mililitros y centrifugue a 500 × g durante 15 minutos con freno bajo; aspire el líquido de los tubos usando una pipeta Pasteur, teniendo cuidado de no perturbar el precipitado. Trate con tampón hemolítico agregando de cinco a seis mililitros a cada tubo y mezclando suavemente para eliminar grumos. Incube durante no más de cinco minutos.

Añada PBS hasta alcanzar un volumen total de 50 mililitros y centrifugue a 230 ×g durante 10 minutos. En centrifugaciones lentas, los recipientes herméticos para aerosoles ya no son necesarios. Lave dos veces, aspire el líquido utilizando una pipeta de Pasteur, rellene el tubo con PBS y centrifugue a 230 ×g durante 10 minutos antes del lavado final. Tome una alícuota de las células resuspendidas, dilúyala con azul de tripano y cuente utilizando un hemocitómetro.

Este recuento celular determinará los volúmenes de reactivo utilizados en la separación de linfocitos T. Paso dos: separación de linfocitos T positivos para CD4, aspire el líquido y agregue tampón de trabajo para llevar el volumen total a 40 microlitros por cada 10 millones de células. Normalmente, esto requiere 30 microlitros de tampón más el volumen residual del precipitado.

Transfiera este volumen a un tubo cónico de 15 mililitros. Añada el cóctel de anticuerpos de los kits de aislamiento de CD4, 10 microlitros por cada 10 millones de células por tubo, y coloque en hielo durante 10 minutos. Retire el tubo del hielo, quite la tapa y añada 30 microlitros de tampón de corrida por cada 10 millones de células.

Añada perlas magnéticas del kit de aislamiento CD4. 20 microlitros por tubo cónico de 10 millones de células y coloque en hielo durante 15 minutos. Añada 10 volúmenes de tampón de corrida para lavar y centrifugue a 230 × g durante 10 minutos.

Durante la centrifugación, prepare el imán y el tubo de polipropileno de cinco mililitros en su área de trabajo. Aspire el líquido del pellet celular. Añada dos mililitros de tampón de lavado y elimine los grumos utilizando una pipeta de transferencia.

Utilizando la misma pipeta de transferencia, transfiera las células al tubo de cinco mililitros e incube en el imán durante 15 minutos. Decante cuidadosamente la fracción de linfocitos T CD4 positivos a un tubo de 15 ml marcado invirtiendo el imán y vaciando todo excepto la última gota. Añada otros dos mililitros de tampón de lavado al tubo de cinco mililitros y retire del imán.

Lave suavemente el CD cuatro células negativas de las paredes del tubo y transfiéralas a un tubo de 15 ml marcado. Añada dos mililitros de medio para linfocitos T a cada tubo. Retire alícuotas para el recuento celular y centrifugue a 230 ×g durante 10 minutos.

Diluya alícuotas celulares con azul de trian y cuente utilizando un hemocitómetro. Estos recuentos celulares determinarán el número de pocillos utilizados para el cultivo de expansión. Paso tres.

Aspirar el líquido del cultivo de expansión in vitro a partir de los pellet de células CD4 positivas y CD4 negativas según el recuento celular. Añadir medio a las células CD4 positivas para ajustar el volumen a 3 millones de células por mililitro. Añadir medio a las células CD4 negativas para ajustar el volumen a 10 millones de células por mililitro.

El cultivo de expansión requiere 3 millones de células CD cuatro negativas por pocillo y de dos a tres millones de células CD cuatro positivas por pocillo. Por lo general, las células CD cuatro positivas son la población limitante. Aliquotar las células CD cuatro negativas en el número adecuado de pocillos de una placa de 48 pocillos.

Añadiendo 300 microlitros a cada pocillo, coloque la placa en un incubador a 37 grados durante una hora. Retire la placa del incubador, lave los pocillos añadiendo 500 microlitros de medio fresco y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo entre 12 y 20 veces utilizando una pipeta de transferencia, y eliminando todo el líquido. Este lavado dejará una capa de células presentadoras de antígeno adherentes.

Una vez finalizada la lavado, agregue suficiente medio solo para humedecer el fondo de cada pozo, aproximadamente 100 microlitros. De lo contrario, las células adherentes se secarán. Si es necesario, agregue de dos a tres millones de células CD4 positivas a cada pozo.

Añada medio adicional para llevar el volumen total en cada pocillo hasta un mililitro. Añada el péptido deseado a cada pocillo. La concentración típica para la estimulación es de 10 microgramos por mililitro.

Coloque la placa final en un incubador a 37 grados durante siete días. Después de siete días, agregue 50 microlitros de hemo IL dos a cada pocillo cada día subsiguiente.

Monitoree el crecimiento celular utilizando un microscopio, alimente los pocillos que aún no están confluentes eliminando la mitad del medio, agregando medio fresco y 50 microlitros de IL; divida los pocillos confluentes suspendiendo las células, transfiriendo la mitad de las células a un pocillo vacío, agregando medio fresco y 50 microlitros de IL, y devolviendo las células al incubador. Las células en expansión estarán listas para la tinción con teer después de 13 a 15 días de cultivo.

Paso cuatro, visualización de linfocitos T mediante tinción con tetrámeros, compre o ensamble tetrámeros que coincidan con el péptido. Combinaciones de péptido-MHC utilizadas para estimular los linfocitos T positivos para CD4. Retire la placa del incubador.

Retire cuidadosamente la mitad del medio de cada pocillo. Transfiera una alícuota de células de cada pocillo, típicamente 75 microlitros o aproximadamente 50.000 células, a un tubo de policarbonato FACS de cinco mililitros, agregue teer generalmente un microlitro por cada 50 microlitros de volumen total y coloque en un incubador a 37 grados durante una hora. También es recomendable teñir una segunda alícuota de cada pocillo con un teer no coincidente como control negativo, etiquetando las células con anticuerpos anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD25.

Pueden utilizarse marcadores de anticuerpos adicionales o alternativos. Sin embargo, no utilice anticuerpos marcados con PE, ya que este canal debe reservarse para los equipos en este momento. Además, marque cualquier control de color único o de isotipo utilizando células adicionales.

Incube las células marcadas con anticuerpos durante 15 a 30 minutos a cuatro grados. Lave cada tubo con 0,5 a un mililitro de tampón de lavado y centrifugue a 230 ×g durante 10 minutos. Deseche cuidadosamente el líquido de los tubos, calibre el citómetro de flujo utilizando perlas de referencia, controles de un solo color, controles isotípicos, y demás.

Analice cada tubo utilizando el citómetro de flujo. Las células tetrapositivas deben constituir una población distinta entre las células T CD4 positivas expandidas. Las células tetrapositivas suelen ser CD25 positivas y a menudo CD4 altas.I.