La preparación estandarizada de un solo suspensiones de células de tejido pulmonar de ratón con el disociador gentleMACS
2 de julio de 2009
Disociar las células de tipos específicos de tejido requiere de parámetros específicos para la agitación del tejido para obtener un alto volumen de células viables, cultivables. El Miltenyi gentleMACS disociador optimiza esta tarea con un protocolo simple y práctico. En esta publicación, el uso de este aparato en el tejido pulmonar se explica.
En este protocolo en video, verá cómo disociar tejido pulmonar de ratón adulto utilizando gentle max tras la disociación del tejido pulmonar. En presencia de colagenasa D y DNasa, las suspensiones celulares se filtran usando un filtro celular de 70 micrones, se centrifugan y se suspenden para aplicaciones posteriores. Hola, soy Melanie Mlu de Mil Biotech en Alemania.
Hoy les mostraré un procedimiento reproducible y automatizado para la preparación de una suspensión de células individuales a partir de tejido pulmonar de ratón mediante la disociación GenX. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para preparar suspensiones de células individuales con el fin de obtener leucocitos o células endoteliales. Bien, comencemos.
Antes de comenzar el protocolo, es necesario preparar y tener a mano algunas soluciones estándar. En primer lugar, necesitaremos tampón Hebes. En segundo lugar, una solución de colagenasa D que contenga 100 miligramos por mililitro de enzima y tampón Hebes.
En tercer lugar, una solución de dase uno que contiene 20.000 unidades por mililitro de dase uno. Por último, dos soluciones amortiguadoras comunes. Un tampón PBS típico a pH 7,2 y un tampón PEB derivado de la solución de lavado AutoMax y la solución stock de BSA.
Iniciamos nuestro protocolo con un pulmón disecado procedente de un ratón hembra de biopsia de seis a siete semanas de edad. Asegúrese de que el pulmón esté libre de órganos adyacentes como el corazón y el timo, vasos sanguíneos eferentes y aferentes, tráquea y tejidos conectivos. Enjuague el tejido en una placa de Petri que contenga PBS para eliminar los eritrocitos.
Típicamente, un pulmón de ratón de esta edad pesa entre 110 y 150 miligramos. Si planea asociar pulmones de animales mayores u otras cepas de ratones, pese el tejido y el tampón. Se puede disociar un máximo de 450 miligramos de tejido por tubo.
Transfiera el tejido pulmonar a un tubo gentle max C cargado con 4,9 mililitros de tampón heis. Añada 100 microlitros de solución de colagenasa D hasta una concentración final de dos miligramos por mililitro al tejido pulmonar y al tampón. Ahora 10 microlitros dase.
Una solución para más de 150 miligramos de tejido. Añada 20 microlitros de la solución de dase. Asegúrese de que el tubo C esté bien cerrado y colóquelo boca abajo sobre el gentle max dis.
Asegúrese de que el tejido se encuentre entre el rotor y el estator. Seleccione el programa para pulmón y ejecútelo presionando el botón de inicio cuando finalice el programa. Retire el tubo C del instrumento e incube la muestra durante 30 minutos.
En un incubador a 37 grados Celsius durante la incubación, el tubo debe rotarse utilizando el rotador de tubos max mix o girarse manualmente cada cinco minutos. Después de la incubación, devuelva el tubo C al asociador gentle max y ejecute el segundo programa pulmonar. Mientras se ejecuta el programa, prepare un tubo de 50 mililitros para recoger las células filtradas reemplazando la tapa por un filtro celular de malla de 70 micrómetros. Una vez finalizado el programa de disociación, dependiendo de la distribución del material de la muestra en el tubo, puede ser necesario centrifugar brevemente el tubo para concentrar el material de la muestra.
Las células disociadas pueden retirarse del tubo mediante pipeteo a través de la tapa sellada con septo del tubo C. Utilizando una punta de pipeta adecuada de 1000 microlitros, se aplica la suspensión celular al filtro celular para eliminar partículas más grandes o agregados. Una vez que la solución haya drenado, lave el filtro celular añadiendo cinco mililitros adicionales de tampón hees a temperatura ambiente para sedimentar las células filtradas.
Centrifugue el tubo de 50 mililitros a 300 ×g durante 10 minutos. A continuación, aspire el sobrenadante y resuspenda el botón celular en el volumen deseado de tampón PEB a temperatura ambiente.
No vierta el sobrenadante. Ahora puede continuar con su aplicación posterior. La disociación del tejido pulmonar de ratón mediante este procedimiento producirá un alto porcentaje de leucocitos y células endoteliales viables.
Las suspensiones de células individuales obtenidas se tiñeron con CD 45 PE, CD 1 46 FITC o CD 31 FITC, y se analizaron mediante citometría de flujo. Este gráfico muestra el enriquecimiento de células dendríticas utilizando microperlas de CD 11 C, un separador minimax y dos columnas MS. Bien. Acabo de mostrarle cómo preparar suspensiones de células individuales a partir de tejido pulmonar de ratón de manera estandarizada, utilizando la disociación suave con tubos C.
Este método permite la disociación eficiente de tejidos genéticos. Al realizar este procedimiento, es importante diseccionar adecuadamente el pulmón y procesar el tejido inmediatamente después de la disección. Las suspensiones de células individuales preparadas pueden utilizarse entonces para experimentos posteriores.
Por ejemplo, la marcación magnética de las células y luego la separación de leucocitos o células endoteliales. Bueno, eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este protocolo en video demuestra la disociación del tejido pulmonar de ratón adulto utilizando el disociador gentleMACS. El procedimiento está diseñado para producir un alto volumen de células viables y cultivables para aplicaciones posteriores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Técnicas de disociación celular
- Preparación de suspensión de células individuales
- Análisis del tejido pulmonar de ratón
Antecedentes
- La disociación de células a partir de tejidos requiere parámetros específicos.
- El disociador gentleMACS proporciona un protocolo optimizado.
- Se utilizan colagenasa D y DNasa en el proceso de disociación.
- Se preparan suspensiones celulares filtradas para aplicaciones posteriores.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método reproducible para preparar suspensiones de células individuales.
- Facilitar el estudio de leucocitos y células endoteliales.
- Proporcionar un protocolo práctico para investigadores en el campo.
Métodos Utilizados
- Uso del disociador gentleMACS para la agitación del tejido.
- Aplicación de colagenasa D y DNasa durante la disociación.
- Filtración de las suspensiones celulares a través de un filtro celular de 70 micrones.
- Centrifugación y suspensión de las células para aplicaciones posteriores.
Resultados principales
- Disociación exitosa del tejido pulmonar de ratón en suspensiones de células individuales.
- Alto volumen de células viables y cultivables obtenido.
- El protocolo demostró reproducibilidad y eficiencia.
- El preparado es adecuado para aplicaciones posteriores.
Conclusiones
- El disociador gentleMACS es eficaz para la disociación de tejido pulmonar.
- Este método puede aplicarse a diversos tipos de tejidos.
- Proporciona una herramienta valiosa para investigadores que estudian el tejido pulmonar.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La disociación estandarizada de tejidos es un paso crítico previo en la investigación de inmunología y biología vascular, lo que permite la preparación reproducible de suspensiones primarias de células para análisis posteriores. El Disociador gentleMACS proporciona un método automatizado, suave y escalable para generar suspensiones de células individuales con alta viabilidad a partir de tejido pulmonar de ratón, facilitando una entrada consistente para citometría de flujo, clasificación celular y perfilado molecular. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en estudios de validación de objetivos al reducir la variabilidad en el rendimiento celular y la viabilidad entre experimentos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de poblaciones de leucocitos y células endoteliales en tejido pulmonar para la comprobación de hipótesis específicas.
- Valor operativo: Reduce la variabilidad manual en el procesamiento del tejido, mejorando la reproducibilidad entre laboratorios y puntos temporales.
- Valor predictivo: Facilita una entrada celular consistente para citometría de flujo y clasificación, aumentando la confianza en los resultados del cribado fenotípico.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Produce suspensiones filtradas y libres de restos adecuadas para tinción con anticuerpos y ensayos basados en flujo.
- Valor operativo: La digestión enzimática y la disociación mecánica estandarizadas garantizan consistencia entre lotes en el rendimiento celular.
- Preparación para ensayos: Genera suspensiones compatibles con aplicaciones posteriores como etiquetado magnético y separación celular.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad para estudiar la dinámica de células inmunitarias y vasculares en tejido pulmonar.
- Soporte del Modelo Preclínico: Permite el aislamiento de células primarias de pulmones de ratones para la desactivación mecanicista de dianas terapéuticas.
- Avance Ajustado al Riesgo: La preparación confiable de células respalda un análisis consistente de biomarcadores y la validación funcional en flujos de trabajo preclínicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El disociador gentleMACS se integra en el flujo de trabajo de descubrimiento como un paso estandarizado de preparación de muestras entre la obtención del tejido y el análisis celular, permitiendo una transición confiable desde tejido ex vivo hasta células individuales listas para ensayos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya el aislamiento basado en hipótesis de células inmunitarias y estromales residentes en el pulmón para el análisis de vías.
- Cribado: Proporciona suspensiones celulares reproducibles para cribados fenotípicos de alto contenido o basados en flujo de moduladores inmunitarios.
- Análisis: Permite lecturas cuantitativas mediante citometría de flujo (por ejemplo, CD45+, CD31+) para comparar condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta modelos murinos de pulmón con estudios de células inmunitarias y endoteliales relevantes para humanos mediante una preparación estandarizada.
- Reutilización Empresarial: El protocolo pulmonar preprogramado del instrumento permite su reutilización en múltiples proyectos que estudian inflamación pulmonar, fibrosis o infección.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: La alta viabilidad y pureza de los leucocitos y las células endoteliales aumentan la calidad de los datos en aplicaciones posteriores.
- Valor operativo: La automatización reduce el tiempo de manipulación manual y la variabilidad dependiente del usuario en la disociación del tejido.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones de avance o interrupción basadas en rendimientos celulares y métricas de viabilidad consistentes.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización ajustada al riesgo de objetivos al proporcionar entradas confiables de células primarias para su validación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere capacitación en disección de tejidos aséptica y manejo enzimático.
- Depende del acceso a un disociador gentleMACS con programa específico para pulmón y tubos C.
- Necesita la estandarización de las concentraciones de enzimas (colagenasa D, DNasa) y condiciones del tampón entre diferentes usuarios.
- Puede requerirse adaptación para distintas cepas de ratones, edades o modelos de enfermedad que afecten la densidad del tejido.
- Se limita a tejidos compatibles con la disociación enzimática; pueden necesitarse alternativas mecánicas para muestras fibrosas o calcificadas.
