Antifouling monocapas auto-ensambladas de microelectrodos de Biomoléculas Patrones

Este procedimiento comienza fabricando un microelectrodo sobre un sustrato de silicona. Se forma una bicapa autosamblada de polietilenglicol sobre el microelectrodo y el sustrato para evitar la contaminación de los microtúbulos. Luego se preparan microtúbulos marcados con rumina.

Finalmente, los microtubúlos se distribuyen sobre los electrodos tratados mediante electroforesis. Hola, soy John Noel del Laboratorio Nana del Departamento de Física y del Laboratorio de Biomecánica Molecular del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad Texas A&M. Soy Wil free Teza del Departamento de Física y director del Centro de Ciencia y Tecnología Habilidad en la Universidad Texas A&M.

Y soy Juan Quang, director del Laboratorio de Biomecánica Molecular del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad Texas A&M. Hoy les mostraremos un procedimiento para fabricar microelectrodos recubiertos con una monocapa autoensamblada no adherente. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el plegamiento de microtúbulos mediante electroforesis.

Así que comencemos. Para empezar, utilice un cortador de obleas o lápiz óptico para cortar obleas de silicio en trozos de un centímetro por 1,5 centímetros que servirán como sustratos. A continuación, limpie los sustratos colocándolos en un vaso de precipitados con suficiente acetona para cubrirlos y someta a ultrasonidos durante cinco minutos sin permitir que los sustratos se sequen.

Lávelos con acetona fresca y luego enjuáguenlos inmediatamente con isopropanol y séquelos con nitrógeno. Mediante litografía fotónica de tono positivo estándar o litografía por haz de electrones, fabrique los microelectrodos de oro sobre los sustratos limpios. Al diseñar la geometría del patrón, mantenga el diámetro de cada patrón de electrodo por debajo de 100 micrones. Para asegurar la cobertura mediante la monocapa autoensamblada de trimetoxisilano de polietilenglicol o peg Sam, incluya pads de contacto posicionados entre 300 y 500 micrómetros del patrón, con una línea de un milímetro que conecte el pad con el electrodo.

Después del desarrollo del patrón en la capa de resistencia, utilice pinzas para rayar una línea en la resistencia desde el pad de contacto hasta el borde del sustrato. Durante la deposición del metal, el rayón permitirá el contacto eléctrico entre el electrodo y el borde del sustrato. Se utiliza una cámara de deposición, preferiblemente con dos fuentes, para depositar la capa metálica.

Los electrodos se forman mediante la deposición de dos nanómetros de cromo, seguidos de seis nanómetros de oro. Sin romper el vacío, se puede utilizar un microbalance de cristal de cuarzo equipado dentro de la cámara para medir el espesor de las películas durante la deposición. Ahora podemos comenzar a preparar la monocapa autoensamblada en un área bien ventilada, precalentar un horno a 75 grados Celsius. Prepare la solución de silanización añadiendo un mililitro de peg silano a 20 mililitros de tolueno en un vaso de precipitados de vidrio de 250 mililitros.

Mezcle bien pipeteando de arriba abajo de cinco a 10 veces y luego agite con la pipeta durante 30 segundos. Coloque las muestras de patrón en el vaso de precipitados con el lado del patrón hacia arriba, asegurándose de que queden completamente sumergidas en la solución y espaciadas uniformemente a lo largo del fondo del vaso. Coloque el vaso en el horno y hornee durante 18 a 21 horas mientras se forma el Sam.

Prepare el electrodo contador depositando un nanómetro de cromo seguido de cuatro nanómetros de oro sobre un cubreobjetos de vidrio de 22 por 50 milímetros. El electrodo contador debe ser casi transparente con un tinte gris claro o rosado. Guarde el electrodo contador con la cara recubierta hacia arriba en una placa de Petri para mantenerlo limpio.

Después de 18 a 21 horas en el horno, retire el vaso de precipitados del horno. El tolueno debería haberse evaporado, dejando las muestras del patrón en un residuo viscoso de peg cline. Añada 20 mililitros de tolueno al vaso de precipitados y remoje las muestras durante uno a dos minutos.

Retire las muestras del vaso de precipitados y enjuáguelas con tolueno, luego con isopropanol y finalmente séquelas con nitrógeno. En este punto, las muestras deben verse limpias y la capa de Sam debe ser invisible a simple vista. Las muestras preparadas de esta manera son utilizables hasta por dos días si se almacenan en condiciones frías y secas.

Una formación fallida de Sam da como resultado un residuo turbio o con tono desigual que recubre la superficie. Con los Sam preparados, ahora podemos comenzar la polimerización de tubulina en microtúbulos. Comience descongelando la tubulina sin marcar y la tubulina con marcaje r, y combínelas inmediatamente en una proporción de dos a uno, sin marcar respecto a marcada, para obtener microtúbulos brillantes.

Mézclelos bien pipeteando arriba y abajo varias veces. A continuación, polimerice la tubulina durante 20 a 40 minutos en un baño de agua caliente a 37 grados Celsius mientras la tubulina se está polimerizando. Prepare un tampón pipes Taxol mezclando 20 micromolar de Taxol con tampón pipee.

Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces y vortexeando, luego coloque el tubo en el baño calentado a 37 grados Celsius. Después de la polimerización, diluya los microtúbulos en tampón de Taxol tibio y protéjalos de la luz. Verifique que la polimerización de microtúbulos haya sido exitosa y que los microtúbulos sean estables bajo varios minutos de excitación de fluorescencia.

Mediante la obtención de imágenes de los microtúbulos preparados con una mezcla eliminadora de oxígeno tras completarse la polimerización de la tubulina en microtúbulos. Comencemos a configurar el MTS mediante electroforesis. Para empezar, corte una tira de cinta adhesiva doble cara en tiras delgadas colocándola sobre un portaobjetos y utilizando una cuchilla de afeitar para cortar; coloque dos tiras de cinta adhesiva doble cara sobre la muestra recubierta con Sam y configurada, de modo que el electrodo quede entre las tiras y el camino de conexión corra perpendicularmente a la cinta.

Coloque el electrodo contador sobre la cinta adhesiva de doble cara con el lado metálico en contacto con la cinta, de modo que el borde de la muestra sobresalga del electrodo contador aproximadamente tres milímetros. Corte varios trozos de alambre magneto de cobre aislado de 15 centímetros de longitud y retire un centímetro del aislamiento en ambos extremos. Utilice una pequeña gota de pintura de plata para fijar un alambre al área de oro expuesta del sustrato, teniendo cuidado de evitar el contacto eléctrico con el electrodo contador.

Ahora use pintura de plata para conectar un segundo cable al electrodo contador. Los cables del electrodo fijados con pintura de plata pueden asegurarse aún más a las muestras con cinta adhesiva. A continuación, utilizando una pipeta, introduzca los microtúbulos a la dilución deseada, observe la imagen a 20 x de magnificación y localice el patrón en la oblea de silicio antes de aplicar un voltaje.

Debido a la profundidad de la cámara de flujo, puede ser necesario utilizar objetivos de larga distancia de trabajo para observar la superficie superior de la cámara. La distancia entre la superficie de la muestra y la superficie superior de la cámara de flujo está determinada por el grosor de la cinta y debe ser de aproximadamente 60 a 100 micrómetros. Aplique un voltaje de hasta un voltio y observe la migración de los microtúbulos.

Si se desea un atrapamiento reversible de los microtúbulos, use esmalte de uñas para sellar la cámara de flujo y evitar la deriva lateral, y utilice voltajes más bajos, hasta aproximadamente 0,5 voltios. La migración se puede rastrear ajustando el plano vertical de enfoque del microscopio con voltajes aplicados de alrededor de 0,9 a 1,2 voltios, momento en el cual los microtúbulos se localizan en las superficies de los electrodos.

Un voltaje más alto hará que la migración sea más rápida y la adhesión más fuerte, pero un voltaje excesivo inducirá electrolisis y despolimerización. Microtúbulos, acaban de mostrarle cómo preparar microelectrodos recubiertos con SAM para el patrón de MT porque el recubrimiento de SAM evita la absorción de microtúbulos en los microelectrodos. Este procedimiento también puede utilizarse para el patrón reversible de microtúbulos.

Además, este proceso no se limita solo a los microtúbulos, sino que también puede utilizarse para configurar biomoléculas en general. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.