La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

El objetivo general del siguiente experimento es desarrollar un sustrato con un patrón bidimensional para controlar la absorción de proteínas y el crecimiento celular. Esto se logra mediante el uso de fotolitografía para fabricar una plantilla patroneada, que se utiliza para producir un sello de A-P-D-M-S para impresión por microcontacto. Como segundo paso, se prepara el sustrato de oro patroneado, lo cual implica la impresión por microcontacto para generar un patrón con regiones que absorben y resisten la proteína.

A continuación, se añaden proteínas y células al sustrato para visualizar el patrón y realizar el estudio. Se obtienen resultados de crecimiento y comportamiento celulares que muestran un buen confinamiento de proteínas y células en estos sustratos patrones, según se observa mediante microscopía de fluorescencia y contraste de fase. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos existentes, como la impresión por MicroCon de proteínas, es que la monocapa terminada en grupos glicol resiste la absorción no específica de proteínas y células en el fondo del patrón.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la técnica adecuada de estampado debe optimizarse para cada patrón impreso. Para comenzar la preparación del molde patroneado, coloque la oblea de silicio en el centrifugador y, durante el paso inicial del programa de centrifugado de dos ciclos, enjuague la oblea con acetona. Durante el segundo paso del programa de centrifugado, la acetona se evaporará, dejando una oblea limpia y seca al inicio del proceso; aplique entonces el fotoresist sobre la oblea y realice el recubrimiento por centrifugado utilizando las condiciones descritas previamente.

Someta la oblea recubierta con resist fotosensible a un horneado suave a 110 grados Celsius durante dos minutos utilizando una placa calefactora de alta uniformidad. A continuación, el patrón fotográfico. La oblea recubierta con resist fotosensible utilizando un sistema de alineación de máscaras y una máscara adecuada.

Primero, coloque el sustrato sobre el carro de vacío del alineador de máscaras. Luego, inserte la máscara en la bandeja del soporte y encienda el vacío para fijar la máscara en su lugar y confirmar un buen contacto entre la máscara y el sustrato. Eleve el sustrato hasta que haga contacto con la máscara.

Utilice la óptica del alineador para confirmar que se ha establecido un buen contacto. Finalmente, encienda la lámpara para exponer el sustrato a la luz ultravioleta a través de la máscara litográfica. Revele la oblea patroneada en revelador durante un minuto con cuarenta y cinco segundos con agitación suave.

Lave minuciosamente con agua desionizada de grado semiconductor y seque con un chorro de gas nitrógeno; verifique el desarrollo del patrón utilizando un microscopio con filtro UV. Comience este procedimiento preparando una mezcla de resina y endurecedor en una proporción de 10 a uno en peso. Mezcle completamente el Cigar 180 2.

Cubra la oblea con patrón fotográfico con la mezcla en una placa de Petri desechable en un desecador al vacío para desgasificar, la matriz recubierta de PDMS hasta que no sean visibles burbujas. Después de asegurarse de que la matriz esté en el fondo del recipiente, deje que el sello se cure en un horno a 65 grados Celsius durante 1,5 horas. Cuando el sello de PDMS esté curado, corte el sello de la matriz y ajústelo al tamaño adecuado.

Guarde el sello en un recipiente cubierto con la cara de las estructuras hacia arriba para protegerlo del polvo y los residuos. Para preparar los sustratos para la deposición de metal, primero trate las laminillas de vidrio redondas con plasma de oxígeno durante 10 minutos. Luego enjuague las laminillas dos veces con agua desionizada, secándolas con una corriente de gas nitrógeno entre cada enjuague; después de enjuagar con agua, enjuague dos veces con etanol, secando nuevamente con una corriente de gas nitrógeno entre cada enjuague.

Utilizando un sistema de deposición por haz de electrones de múltiples bolsillos, deposite 50 angstroms de titanio seguidos de 150 angstroms de oro. No ventile el evaporador entre la deposición de la capa de titanio y la capa de oro. Enjuague el sello de PDMS con etanol y séquelo completamente.

Con gas nitrógeno, aplique la solución de estampado al sello gota a gota hasta que esté completamente recubierto. Seque completamente el sello con gas nitrógeno. La impresión por contacto microscópico del archivo HEXA Decano depende de las características del sello de PDMS y es uno de los aspectos más difíciles de este procedimiento.

El estampado exitoso requiere el desarrollo de una buena técnica que aplique presión uniforme durante el proceso. Para la impresión por contacto microconvencional en aire, presione suavemente el sello sobre el sustrato de oro y permita que se forme la monocapa durante 15 segundos.

Alternativamente, para patrones compuestos por características muy pequeñas y altas relaciones de aspecto, coloque el sustrato de oro en una placa de Petri que contenga agua desionizada de 18,2 mega ohmios, asegurándose de que el sustrato quede sumergido. Luego, presione suavemente el sello sobre el sustrato de oro y permita que se forme la monocapa durante 15 segundos. A continuación, enjuague el sustrato sellado dos veces con etanol y séquelo con gas nitrógeno.

Después de cada enjuague, coloque el sustrato en una placa de Petri y cubra el sustrato con solución de relleno posterior. Selle la placa con parafina para prevenir la evaporación. Deje formar la monocapa de fondo en la oscuridad durante 12 a 14 horas.

Finalmente, retire la cubreobjetos patroneada de la solución de relleno posterior y enjuáguela dos veces con etanol, secándola con gas nitrógeno después de cada enjuague. Para aplicar la proteína sobre la cubreobjetos patroneada, coloque la cubreobjetos en una pequeña placa de Petri o en una cámara de cultivo celular. Cúbrala con 500 microlitros a un mililitro de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS). La DPBS debe cubrir completamente el sustrato durante la incubación con la proteína.

Para garantizar una cobertura uniforme de proteína, agregue una solución concentrada de proteína al DPBS y mezcle la solución pipeteando varias veces. Incube la mezcla de proteína con el sustrato a 37 grados Celsius durante una hora. Después de la incubación, enjuague el sustrato cuidadosamente con DPBS para eliminar la proteína no unida, teniendo cuidado de no secar el sustrato ni exponerlo a la interfase aire-agua.

Después de tres lavados, aspire el DPBS. A continuación, agregue aproximadamente 500 microlitros de medio completo de crecimiento celular para mantener un sustrato húmedo. Reemplace el medio de crecimiento utilizado para lavar el sustrato.

Con medio fresco, el sustrato ya está listo para sembrar células. Típicamente, se siembran entre 30 y 200 células por milímetro cuadrado sobre el sustrato. Esta imagen muestra el sello A-P-D-M-S visualizado bajo un microscopio colocando la cara del sello con las estructuras hacia abajo sobre un cubreobjetos de vidrio; la barra de escala mide 100 micrómetros.

Un estampado adecuado da como resultado un patrón de proteína nítido y claro que puede visualizarse mediante la aplicación de una proteína marcada con fluorescencia, como la fibronectina marcada con LOR 6 47. Aquí se muestra el confinamiento de las células chk one al patrón de proteína. Las barras de escala miden 100 micrómetros en estas imágenes.

Alternativamente, la inmunohistoquímica puede utilizarse para visualizar el patrón de proteínas tras la fijación con SU. Aquí, se utiliza el anticuerpo anti-laminina conjugado con LOR tres 50 para visualizar la laminina dispuesta en patrón y sembrada con neuronas del hipocampo de ratón E 18, mostradas a los cuatro días in vitro. Las neuronas del hipocampo de ratón E 18 teñidas con el marcador MIT rojo cinco 80 muestran que el crecimiento celular está bien confinado al patrón de proteína. Aunque esta técnica es fácil de dominar, pueden surgir varios problemas comunes, como se ilustra mediante estas preparaciones de sustratos patrones visualizadas por absorción de fibronectina conjugada con LOR 6 47.

La aplicación de la proteína sin una mezcla suficiente de la solución concentrada de proteína en el DPBS puede provocar patrones de proteína irregulares. Un estampado inadecuado puede provocar una transferencia parcial del patrón o el colapso del sello. Además, exponer el sustrato con el patrón que contiene proteína absorbida al aire puede alterar la monocapa, lo que provoca una disminución de la resistencia.

En segundo plano, el patrón sumergido puede producir estructuras con características pequeñas que son difíciles de imprimir mediante la impresión convencional por microcontacto y aire. Estas dos imágenes muestran regiones diferentes del mismo patrón impreso con el mismo sello de PDMS en aire o en agua desionizada; las líneas de soporte se muestran en la imagen de la izquierda para demostrar que solo las características pequeñas del patrón no se imprimieron correctamente. Las barras de escala miden 20 micrómetros. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 18 a 24 horas si se lleva a cabo adecuadamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar un sustrato con patrón. Producir un sello A-P-D-M-S. Utilizar la impresión por microcontacto para preparar un sustrato de oro con patrón y visualizar este patrón mediante proteínas y células.