Lentivirus de producción

Este procedimiento comienza con la transducción de células 293T con lentivirus, plásmido y vectores de empaquetamiento viral; el sobrenadante viral se recoge tras un período de incubación de al menos 48 horas. El sobrenadante se filtra y se concentra mediante ultracentrifugación. El precipitado viral se resuspende en PBS para obtener la titulación del virus: primero se diluye el virus concentrado en medio completo, luego se realiza una dilución seriada para infectar células con lentivirus.

Hola, soy Shein Wong del laboratorio de Michael McManus en el Centro de la Diabetes de la Universidad de California en San Francisco. Soy Michael McManus. Hoy les mostraremos un procedimiento para la producción de lentivirus.

Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para producir lentivirus destinados a la interferencia de ARN. Comencemos. Para iniciar este protocolo, prepare el ADN con el que se transfectarán las células 2 9 3 T.

Primero, diluya el reactivo de transfección FU gene seis en un tubo de 1,5 mililitros mezclando 30 microlitros de Fuji seis con 600 microlitros de medio sin suero. Tenga cuidado de no dejar que Fuji toque las paredes del tubo al agregarlo al medio; incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, en la tapa del tubo, mezcle cuatro microgramos de plásmido lentiviral con 1,33 microgramos.

Cada vector de empaquetamiento viral de tercera generación. El plásmido lentiviral contiene el ADN. El virus se insertará en el genoma de cada célula que infecte, mientras que los vectores de empaquetamiento contienen los genes para todas las demás proteínas necesarias para producir un virus lentiviral; cierre la tapa y mezcle invirtiendo el tubo varias veces.

Incube el ADN y el reactivo de transfección durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente. Ahora es el momento de transfectar las células 293 con el ADN que ha preparado; utilice células que haya sembrado con 24 horas de antelación y que hayan alcanzado una confluencia del 50 al 70 % en la cabina de cultivo celular. Pipetee todo el ADN preparado sobre la placa de células 293 y mezcle suavemente inclinando la placa hacia adelante y hacia atrás. Devuelva las células al incubador y permita que la producción viral continúe durante 48 a 96 horas antes de la recolección. Durante la incubación, las células 293 producen lentivirus cuyos genomas contienen una copia de ARN de su ADN de interés.

Ahora es el momento de recolectar el virus. Saque sus células del incubador. Tenga listo en la cabina de cultivo celular un filtro para jeringa de 0,4 o cinco micrones, una jeringa desechable de 10 mililitros y un tubo de centrífuga UltraClear de Beckman.

Utilice la jeringa desechable para eliminar el sobrenadante, que ahora contiene el virus. Coloque un filtro de jeringa de 0,45 micrones en la punta y filtre el virus hacia un tubo de centrífuga UltraClear de Beckman. El filtro permite el paso únicamente de virus y no de células; antes de desecharlas, incube todas las células productoras de virus.

Incube placas de cultivo, jeringas y filtros en lejía al 10 % durante 45 minutos. Ahora que ha recolectado y filtrado el virus, es momento de concentrarlo mediante ultracentrifugación. Utilice DMEM sin suero para equilibrar todos los tubos que contienen el virus, de modo que su peso no difiera en más de 0,2 gramos entre ellos.

A continuación, cargue los tubos de centrífuga equilibrados en los cubos del rotor SW 41 TI o SW 28. Cierre herméticamente los cubos del rotor y colóquelos en el rotor. Luego, coloque el rotor dentro de la ultracentrífuga.

Centrifugar el virus durante aproximadamente 90 minutos a cuatro grados Celsius a 25.000 RPM en un rotor SW 41 TI, o a 24.000 RPM en un rotor SW 28. Después de la centrifugación, regresar a la cabina de cultivo celular e invertir el tubo para verter el SNAT en un recipiente que contenga lejía al 10 %. Utilizar una toalla Kim para absorber el exceso de líquido alrededor del precipitado e invertir el tubo en un portatubos adecuado durante no más de cinco minutos, hasta que esté listo para resuspender el precipitado.

Para resuspender el sedimento viral, utilice una punta filtrante para agregar 100 microlitros de PBS estéril previamente filtrado al tubo. Luego, pipetee hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 20 veces. Deje el virus a cuatro grados durante la noche para completar la resuspensión.

Puede almacenar las preparaciones virales a cuatro grados durante aproximadamente una semana y a menos 80 grados durante hasta un año. Recuerde tratar todos los tubos vacíos con lejía al 10% antes de desecharlos. Si tiene la intención de utilizar la preparación viral durante más de una semana, esta se conservará en el refrigerador.

Prepare alícuotas mínimas de cinco a 20 microlitros para experimentos futuros y una alícuota de tres a cinco microlitros para la titulación; congele y almacene las alícuotas a aproximadamente menos 80. El siguiente paso consiste en determinar el título viral. Si ha incluido un gen reportero fluorescente en su plásmido lentiviral, las células infectadas fluorescerán y podrá determinar el título viral mediante citometría de flujo.

Para comenzar, diluya tres microlitros de virus concentrado en 1,5 mililitros de medio completo en los pocillos del uno al seis, en una sola fila de una placa de 96 pocillos. Realice las siguientes diluciones seriadas en los seis pocillos con 100 microlitros de DM completo. Al primer pocillo añada 100 microlitros de medio sin virus.

Este es su control sin teñir. Al segundo, agregue 100 microlitros del virus diluido al tercero. Agregue 100 microlitros de la mezcla del segundo pocillo al cuarto.

Añadiremos 100 microlitros desde el tercer pocillo hasta el quinto. Añadiremos 100 microlitros desde el cuarto pocillo hasta el sexto. Añadiremos 100 microlitros desde el quinto pocillo.

Finalmente, retire 100 microlitros del sexto pocillo y deseche. Añada lejía y complete el volumen total en todos los pocillos hasta 200 microlitros con DMEM. Con cada dilución, la concentración viral se reduce a la mitad. Tenga en cuenta que estas son solo diluciones sugeridas, que deberían funcionar bien para la titulación de la mayoría de los virus concentrados.

Si su virus tiene un título bajo o no está concentrado, es posible que necesite ajustar sus diluciones. Trate cualquier virus diluido no utilizado con lejía al 10 % durante 45 minutos antes de desecharlo en un recipiente de desecho biopeligroso. Añada aproximadamente 15 000 células 293T sanas y en división activa a cada uno de los seis pozos.

Puede utilizar una sola placa de 96 pocillos para titular 16 preparaciones virales, completar los pocillos hasta 200 microlitros, devolver las células al incubador y permitir que la infección transcurra durante al menos 48 horas. Después de la incubación, analice la fluorescencia celular utilizando un citómetro de flujo. Puede utilizar el porcentaje de células fluorescentes por pocillo para determinar el título o el número de partículas virales infecciosas por mililitro de virus añadido.

Calcule el número de unidades infecciosas por mililitro con la siguiente fórmula al interpretar los resultados del citómetro de flujo. Tenga en cuenta que solo se pueden obtener cálculos precisos del título cuando las células infectadas han recibido no más de una integración viral por célula.

Para asegurarse de que este sea el caso, utilice células con una tasa de infección inferior al 15% para los cálculos. Es probable que las células con tasas de infección más altas hayan recibido múltiples integraciones virales por célula. La dilución sugerida en el paso dos debería producir varias muestras dentro de este rango de infección.

Utilice idealmente varias muestras para generar una curva de titulación a partir de la cual pueda calcular la titulación final. Se puede utilizar la fórmula calculada a partir de la recta lineal ajustada para determinar la titulación viral, aunque puede calcular la titulación utilizando una sola muestra si es necesario. Se puede esperar una titulación de uno por diez a la séptima unidades transducentes por mililitro para virus no concentrado, y uno por diez a la octava unidades transducentes por mililitro para virus concentrado.

Acabamos de mostrarle cómo producir lentivirus al realizar este procedimiento. Es importante cumplir con todas las regulaciones de bioseguridad y desechar los residuos adecuadamente. Eso es todo.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.