Embalaje VIH o FIV basados ​​en lentivirus Construcciones de expresiones y de transducción de la VSV-G partículas virales pseudotyped

El objetivo general de este procedimiento es aprender sobre el empaquetamiento de lentivirus. Un protocolo de cinco días. El primer día, las células productoras 293TN se siembran a una densidad calculada.

El segundo día, las células se transfectan con el constructo de vector lenti de elección que contiene el gen de interés y la mezcla de plásmidos de empaquetamiento viral. El cuarto día, se recolecta el sobrenadante viral y se concentra agregando la solución de precipitación viral con PEG. Los pasos finales del procedimiento consisten en recolectar el virus concentrado con PEG, alícuotar el virus e infectar células con el virus concentrado para la titulación viral.

Finalmente, la PCR cuantitativa de genes integrados de forma estable se utiliza para calcular el número de constructos integrados de manera estable. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la transfección con plásmido o la transducción retroviral es que el protocolo optimizado de empaquetamiento de lentivirus de FBI produce un virus funcionalmente activo con título elevado, lo que permite una entrega eficiente en casi cualquier célula mamífera, incluidas células difíciles de transfectar como las células madre y las células primarias no divididas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no están familiarizadas con los pequeños detalles del protocolo, que son esenciales para la producción exitosa de virus con alto título.

La demostración visual de este método es útil, ya que la densidad celular visualizada mediante microscopio durante la transfección determina la eficiencia del empaquetamiento viral, lo que a su vez determina la titulación viral final. En los casos en que la expresión del reportero fluorescente aplicable determina la eficiencia de la transfección, esto tiene un impacto significativo en la titulación viral final. Además, la demostración visual de este método resulta útil para que los investigadores se familiaricen con aspectos sutiles pero importantes del protocolo, como las mejores prácticas para mantener la esterilidad durante todo el proceso, y cómo evitar incluir restos celulares en el virus recolectado.

El empaquetado eficiente de lentivirus depende de tres componentes. Primero, el vector de expresión lentiviral debe contener algunos de los elementos necesarios para el empaquetado del virus y la integración estable, así como elementos para la expresión del gen de interés: interferencia por ARN en horquilla corta, ARN, microARN o un casete reportero.

Segundo, los plásmidos de empaquetamiento lentivirales deben proporcionar las proteínas esenciales para empaquetar una copia de ARN del constructo de expresión en partículas pseudovirales recombinantes y para la posterior transcripción inversa e integración viral tras la infección. En tercer lugar, las células productoras 293TN deben transfectarse transitoriamente de forma conjunta con los vectores de expresión y de empaquetamiento. Estas células producen partículas pseudovirales con títulos altos que se pueden recolectar del medio de cultivo.

En última instancia, la transducción exitosa de las células diana depende principalmente del número de partículas virales por célula para un tipo celular determinado. En otras palabras, la multiplicidad de infección comienza cultivando células 293TN en placas de cultivo celular de 15 centímetros durante 18 a 24 horas para obtener un 60 a 80% de confluencia.

En el momento de la transfección, cada placa producirá aproximadamente 14 millones de células para aumentar el rendimiento del virus. Al día siguiente, se puede utilizar más de una placa cuando las células 293TN alcancen una confluencia del 60 al 80 %, momento en el que estarán listas para la transfección. Por cada placa de células, añada 1,6 mililitros de DMEM sin suero a un tubo cónico de 15 mililitros.

Luego, agregue 22,5 microgramos de ppac H uno o Ppac F1 y 4,5 microgramos de su construcción del vector lentiviral al DMEM y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, agregue 55 microlitros de pure affection al mismo tubo y vortexee durante 10 segundos, seguido de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, agregue un tubo a cada placa de cultivo.

Agregue gota a gota y luego gire suavemente la placa, e incube las células durante 48 horas a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono tras 48 horas. Si el vector lentiviral expresa un gen fluorescente como GFP, revise las células bajo el microscopio; una transfección exitosa producirá entre el 50 y más del 90 % de células verdes fluorescentes. Ahora, recoja el sobrenadante del cultivo celular en un tubo cónico de 50 mililitros. El sobrenadante contiene partículas pseudovirales infecciosas.

Cualquier célula que se desprenda de la placa no afectará negativamente la producción del virus. Para eliminar los restos celulares, centrifugar el sobrenadante viral a 1500 G durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, sin perturbar el sedimento, recoger el sobrenadante viral asegurándose de dejar un tampón de aproximadamente 500 microlitros de sobrenadante y proceder al siguiente paso, que consiste en concentrar las partículas virales 72 horas tras la transfección.

Puede realizarse una segunda recogida opcional del sobrenadante viral utilizando la misma técnica después de recoger el sobrenadante viral. Concentre agregando un volumen de solución fría de precipitación viral con PEG a cada cuatro volúmenes de sobrenadante en un tubo cónico de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros. Invierta la solución para mezclarla.

Nunca utilice un vórtex; luego, almacene la solución sin agitación a cuatro grados Celsius durante un máximo de 96 horas. Tras un mínimo de 12 horas de refrigeración, centrifugue la mezcla a 1500 G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Tras la centrifugación, las partículas lentivirales precipitadas con PEGgo aparecerán como un sedimento beige o blanco en el fondo del tubo.

Ahora, elimine todas las trazas de líquido mediante aspiración cuidadosa sin perturbar las partículas lentivirales precipitadas en el sedimento. Alternativamente, retire la mayor parte del sobrenadante y resuspenda el sedimento en el sobrenadante restante. Luego, transfiera la suspensión a un tubo eppendorf estéril de dos mililitros y centrifugue el tubo en una microcentrífuga fría durante dos minutos.

A 14.000 RPM, retire con pipeta el sobrenadante restante y resuspenda el pellet de partículas lentivirales en hielo, en un tampón estéril y frío, entre un décimo y un centésimo del volumen original. Pipete cuidadosamente el pellet hacia la solución sin crear burbujas, manteniéndolo frío en todo momento. Asegúrese de que el pellet se resuspenda completamente.

Por último, prepare alícuotas de 15 a 25 microlitros de tinta en viales criogénicos estériles sobre hielo y almacene los viales a menos 70 grados Celsius. Un proceso de empaquetamiento exitoso producirá de 10 millones a 1000 millones de UIF por mililitro para la transducción viral en una placa de cultivo de 24 pocillos, con 50.000 células por pocillo, y cultívelas durante la noche en sus condiciones de cultivo especificadas. Las células deben tener una confluencia entre el 50 y el 70 % para la transducción con fines de titulación.

Las células HT 10 80 pueden utilizarse como una línea celular control fácil de transducir; al día siguiente, aspire el medio de las células. Luego combine el medio de cultivo con la solución concentrada de transductores. De modo que la concentración final de transductores sea 1x, añada medio mililitro de la solución transducida a cada pocillo con células diana a la densidad adecuada de 50 a 70 % de confluencia. Añada el virus a cada pocillo en las siguientes diluciones: 1:100, 1:10 y dilución directa 1:1.

El virus puede permanecer en contacto con las células diana hasta 72 horas sin cambiar el medio. Después de 72 horas, el provirus se habrá integrado establemente en el genoma del huésped y estará expresando el gen de interés. Si hay expresión de un marcador fluorescente, esta puede utilizarse para estimar la eficiencia de transducción con diferentes diluciones del virus, y luego el número de unidades infecciosas puede cuantificarse mediante QPCR.

Una vez conocido el título del virus, calcule el volumen apropiado de virus para alcanzar la multiplicidad de infección deseada en otras células diana. La medición del título y el control de la MOI garantizan la consistencia entre experimentos y diferentes preparaciones virales. El virus ya está listo para su uso en experimentos adicionales.

La densidad inicial de las células 2 9 3 TN fue fundamental para un empaquetamiento viral exitoso el día de la transfección. Estas células 2 9 3 TN presentaban un grado de confluencia entre el 60 y el 80 %. Veinticuatro horas después de una transfección exitosa con un vector lentiviral que expresa GFP, se observó que al menos el 90 % de las células 2 9 3 TN mostraban fluorescencia verde.

72 horas posteriores a la transducción, GFP continuó expresándose en las células huésped HT 10 80. Esto indica que el constructo lentiviral se integró establemente en el genoma del huésped; transducir las mismas células huésped en una dilución diez veces menor disminuyó proporcionalmente la expresión de GFP. Debido a que la relación entre el título vírico y la expresión génica mediada por lentivirus es directamente proporcional.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un período de cinco días, con una dedicación aproximada de una a dos horas por día, si se lleva a cabo correctamente. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo empaquetar partículas virales infecciosas de forma eficiente y segura, y transducir células con éxito mediante el virus. No olvide que trabajar con lentivirus puede ser peligroso y que es necesario tomar precauciones, como trabajar en una cabina de cultivo celular de nivel de seguridad biológica dos (BSL-2).

Siempre se debe usar bata de laboratorio y guantes al realizar este procedimiento.