Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila

Con el fin de realizar las reconstrucciones de órganos en desarrollo en Drosophila melanogaster, es necesario determinar el modelo directo que mejor describa la propagación de la luz dentro de la pupa misma. El procedimiento comienza seleccionando una prepupa blanca y pegándola en el extremo de un tubo capilar de manera que el eje anteroposterior de la prepupa quede orientado paralelo al tubo. Un pequeño tubo capilar se llena con un colorante fluorescente y se inserta en el caso de la pupa.

Después de un ajuste cuidadoso del eje, la pupa se rota 360 grados. Se adquieren imágenes en diferentes ángulos. Los datos adquiridos de transiluminación fluorescente se utilizan para determinar el modelo directo que se empleará para imaginar el desarrollo de órganos.

Hola, mi nombre es Claudia y estoy en el Centro de Biología Asistencial del Hospital General de Massachusetts, Escuela Médica de Harvard. Soy Ula Petou del Laboratorio Paramount de la Escuela Médica de Harvard, y soy Daniel Rozanski del Instituto de Imagen Biológica y Médica de la Universidad Técnica de Múnich y del Centro Heliman Múnich. Hoy les mostraremos un procedimiento para la reconstrucción tridimensional de todo el cuerpo en Oph Melano Casta.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para la visualización in vivo del desarrollo de órganos durante el estado pupilar. Así que comencemos. Antes de iniciar, tenga en cuenta que no existe un video complementario que deba verse previamente a este, en el cual algunos aspectos técnicos de la tomografía de proyección óptica se explican con mayor detalle que aquí.

Además, el otro video explica la obtención de imágenes de tejidos u órganos preparados de animales más grandes. Para todos los experimentos descritos en este video, se utilizarán transgenes de *Drosophila* forjados. Estos son EL A gal cuatro expresado en las glándulas salivales, apteris gal cuatro, que se expresa en los tejidos precursor larvales del ala y el tórax adultos, y el transgen que produce la proteína fluorescente.

En respuesta a Gal4 llamado U-A-S-G-F-P y blanco 1118, los machos de control no fluorescentes que portan los transgenes UAS se cruzan con hembras vírgenes que portan los transgenes Gal4 para lograr la expresión específica en el tejido. Los cruces para expresar GFP se establecen con entre ocho y 10 hembras vírgenes y machos en medio estándar para moscas con una pizca de levadura de cerveza. Los frascos se mantienen a 25 grados Celsius en un incubador humedecido bajo un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.

Dos días después del inicio del cruzamiento, los padres se transfieren a un vial fresco y cinco o seis días después, los PUI comenzarán a poblar el vial con PrepU. Se seleccionan los individuos que expresan GFP bajo un microscopio estereoscópico fluorescente. La selección de pre-PUI blancos asegura el estadio adecuado de los animales, ya que permanecen blancos durante aproximadamente una hora.

Después de la pigmentación, se vuelven pigmentados o de color marronoso. Los pui que expresan GFP se recogen suavemente de los viales utilizando un pincel húmedo y se colocan en una gota de agua o PBS en una placa de Petri, pero deben limpiarse completamente de materiales autofluorescentes. Utilizando el pincel, ahora deberían estar listos para la imagen tomográfica.

Si las PrepU necesitan continuar envejeciendo para alcanzar la etapa de desarrollo correcta, se pueden dejar en un plato de Petri con una toalla de papel húmeda o en un vial de alimento limpio. Esto garantizará una humedad suficiente y un desarrollo adecuado para la obtención de imágenes. Las PrepU deben adherirse al interior de un tubo capilar de vidrio con un diámetro de 800 micrones.

Pinte el extremo posterior de la pupa con pegamento instantáneo y oriente la superficie pegada de la prepupa dentro del tubo de manera que el eje anterior-posterior de la mosca sea paralelo al tubo. La parte anterior del animal quedará sobresaliendo del tubo capilar. Ahora el tubo capilar está fijado sobre la platina rotatoria del microscopio.

En posición vertical, ajuste el eje de inclinación del escenario rotacional de modo que el eje de rotación del tubo quede paralelo a las columnas de píxeles del CCD de imagen. Con la posición de la mosca ajustada, continúe con la adquisición de imágenes. En este ejemplo, se deben imaginar animales con glándulas salivales fluorescentes para que los que expresan GFP en sus glándulas salivales puedan generarse a partir de un cruce entre las cepas EAG cuatro y U-A-S-G-F-P.

Comenzamos con una prepupa montada, iluminamos la prepupa con un haz de excitación y recolectamos la señal fluorescente de GFP. En la transiluminación, gire el PrepU 360 grados alrededor de su eje vertical y adquiera las imágenes de transiluminación. Cada imagen corresponde a 10 grados de rotación.

El tiempo total de adquisición depende de la cantidad de fluorescencia y de la intensidad del haz de excitación. Los tiempos típicos son del orden de un minuto. En este ejemplo, se obtendrá una imagen de una pupa de DSO que expresa GFP en los discos imaginales de las alas.

Esta pupa puede recolectarse de un vial de un cruce entre las cepas Aus GAL cuatro y U-A-S-G-F-P. La prepupa se monta como se describió anteriormente. Sin embargo, dado que el tiempo de adquisición de imágenes para este experimento es de aproximadamente ocho horas, es fundamental que el ambiente permanezca húmedo y a temperatura ambiente para evitar la deshidratación y la muerte del animal. Se coloca un obturador sobre el haz de excitación para evitar el apagado de los florales cuatro en el tejido de interés, así como para garantizar que el animal no se queme debido al haz láser; como antes, ilumine con el haz de excitación y recoja la señal fluorescente de GFP mediante iluminación transmitida.

La prepupa gira completamente alrededor de su eje vertical. Durante la recopilación de datos, la rotación dura solo un minuto y se repite a diferentes intervalos de tiempo. Para crear una serie de imágenes lapse de las alas durante su desarrollo, se pueden adquirir datos durante al menos seis horas a una velocidad de 100 imágenes por hora.

Es fundamental que la exposición total a la luz se controle con este obturador para prevenir daños o fotoblanqueo. Esta película muestra imágenes adquiridas entre la etapa PrepU y la aversión del cabeza del pupilo. Al reconstruir la imagen tridimensional, existe un fuerte dispersión hacia adelante que debe tenerse en cuenta, la cual no puede aproximarse mediante difusión.

Por lo tanto, para realizar la reconstrucción, debe determinarse un modelo de dispersión hacia adelante de la propagación de la luz. Por simplicidad, se desprecia la absorción. La cantidad de dispersión se prueba experimentalmente. Para ello, se inserta un objeto extraño con fluorescencia estandarizada en una prepupa blanca no fluorescente de 1118, que luego se escanea para generar los datos del modelo hacia adelante. Comience llenando un tubo capilar de sílice de 100 micrones con colorante fluorescente PS 5.5.

Utilizando la acción capilar, introduzca el tubo capilar en la pupa en un ángulo de 45 grados respecto al eje anterior, monte el PrepU en un tubo capilar y colóquelo adecuadamente sobre la plataforma giratoria tal como se describió anteriormente. A continuación, ilumine la prepupa con un haz láser de excitación mediante una lente de baja apertura numérica y capture imágenes fluorescentes de transiluminación de la prepupa. Como se describió previamente, se utiliza el software MATLAB para ajustar los datos al modelo teórico explícito directo. Para facilitar el proceso de reconstrucción, se selecciona la aproximación difusa a la ecuación de transporte, ya que describe el régimen de dispersión directa y también se ajusta a los datos experimentales.

Una vez determinado el modelo directo correcto, podemos reconstruir las glándulas salivales y obtener reconstrucciones tomográficas de lapsos de tiempo. Si planea utilizar una tomografía en espacio libre, también se pueden configurar algoritmos de configuración para la coincidencia de índices. Primero, mostramos una reconstrucción 3D de las glándulas salivales a inicios del desarrollo.

Para comparación, la tinción histológica de las glándulas salivales muestra que las reconstrucciones se correlacionan bien con la histología. Esta película de lapsos de tiempo del desarrollo de los discos imaginarios de las alas se obtuvo a partir de un único espécimen vivo. Para comparación, la tinción histológica del disco alar en los mismos puntos temporales muestra que las reconstrucciones se correlacionan bien con la histología.

Acabamos de mostrarle cómo construir un sistema para obtener imágenes de estructuras tridimensionales dentro de oph in vivo y a lo largo del tiempo. Esto nos permite seguir la morfogénesis en Drosophila y observar el desarrollo de las alas durante seis horas consecutivas. Al realizar este procedimiento, es fundamental elegir el modelo directo correcto para la propagación de la luz dentro de Drosophila.

Este método puede utilizarse en combinación con técnicas histológicas para arrojar luz sobre el desarrollo de órganos durante las etapas de oph pupil, y puede modificarse para el estudio de diferentes organismos de tamaño similar. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.