Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

En esta técnica, las laminillas de vidrio se funcionalizan con una mezcla de moléculas de PEG inertes y biotiniladas. Se crea una celda de flujo con esta superficie funcionalizada y se coloca en un microscopio TIRF. Las plantillas de amplificación por rolling circle biotiniladas se fijan a la superficie utilizando estreptavidina multivalente.

Cuando los sustratos se replican mediante la adición de proteínas de la zona de replicación y nucleótidos, el ADN bicatenario resultante se extiende mediante flujo laminar y se visualiza en tiempo real utilizando un colorante intercalante. Hola, soy Nathan Tanner del laboratorio de Antoine Van Oijen en el Departamento de Química Biológica y Farmacología Molecular de la Escuela de Medicina de Harvard. Soy Joe Loparo, también del laboratorio de Van Oijen.

Hoy les mostraremos un procedimiento para la obtención de imágenes de fluorescencia de la replicación del ADN en tiempo real a nivel de molécula individual. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las actividades coordinadas de síntesis de ADN de complejos de replicación individuales. Así que comencemos.

Para comenzar este procedimiento, anile el oligo con cola biotinilada al ADN monocatenario M13 añadiendo un exceso diez veces mayor de oligo en tampón TBS, calentando a 65 grados Celsius y luego apagando el bloque térmico para permitir un enfriamiento lento que permita la correcta hibridación del cebador. Ahora que el cebador M13 está listo, añádalo a una mezcla de 64 nanomolares de polimerasa T7 y tampón de replicación T7 que contiene dNDPs y cloruro de magnesio, e incube la reacción a 37 grados Celsius durante 12 minutos. Al final de la incubación, detenga la reacción con EDTA 100 milimolar.

A continuación, purifique el ADN del producto rellenado mediante extracción con fenol-isoamilo-alcohol-cloroformo y diálisis en tampón TE u otro tampón de almacenamiento adecuado. Realice extracciones posteriores de cada fase orgánica para recuperar cualquier cebador residual. Tras la diálisis, determine la concentración de ADN mediante un espectrofotómetro UV-vis. Una sola iteración de preparación de la plantilla puede generar una concentración nanomolar suficiente de plantilla para cientos o miles de experimentos de molécula individual.

Ahora que el ADN está listo, proceda a preparar las laminillas funcionalizadas. El ADN que se va a replicar se une a laminillas de vidrio funcionalizadas con Amil Lane, en las que el grupo Oxy del Amil se enlaza al vidrio, dejando un amin disponible para unir moléculas de peg biotiniladas. Este recubrimiento ayuda a reducir la unión no específica a la superficie.

Para limpiar completamente las laminillas de vidrio, colóquelas en frascos para tinción y llene los frascos con etanol sometido a sonicación. Enjuague los frascos durante 30 minutos, luego llénelos con hidróxido de potasio uno molar y sométalos a sonicación durante 30 minutos; repita ambos lavados. Para la primera reacción de funcionalización, es necesario eliminar todos los rastros de agua.

Llene los frascos de tinción con acetona y sométalos a sonicación durante 10 minutos. Vacíe los frascos y llénelos nuevamente con acetona. A continuación, añada el reactivo sine a los frascos y agite durante dos minutos.

Luego, enfríe con un gran exceso de agua. A continuación, seque las laminillas horneándolas a 110 grados Celsius durante 30 minutos. Después, prepare la mezcla de PEG al aproximadamente 0,2 % peso por volumen mediante PEG aminado; incluya un espaciador de laminilla de vidrio para permitir la separación de las laminillas, y agregue 100 microlitros mediante pipeta sobre una laminilla silanizada seca.

Coloque un segundo cubreobjetos encima. Incube los cubreobjetos en la solución de PEG durante tres horas. Luego, separe cada par de cubreobjetos y lávelos extensamente con agua.

Tenga cuidado de mantener los cubreobjetos con el lado funcionalizado hacia arriba, ya que solo un lado estará recubierto con peg. Finalmente, seque los cubreobjetos con aire comprimido y guárdelos al vacío en un desecador; las superficies permanecen estables durante al menos un mes. Así, se pueden fabricar docenas de cubreobjetos en un lote y utilizarlos según sea necesario.

Ahora que los cubreobjetos están listos, se puede armar la cámara de flujo para el experimento de molécula individual. Comience colocando de 20 a 25 mililitros de tampón bloqueante que contenga BSA en un desecador para eliminar cualquier burbuja de aire en pasos posteriores. A continuación, diluya 25 microlitros de estreptavidina en 100 microlitros de PBS y extienda la solución sobre la superficie de un cubreobjeto funcionalizado con perno, incube durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir que la estreptavidina se una a la biotina de la superficie mientras prepara las otras partes de la cámara.

Mientras la cubreobjetos está incubando, corte un trozo de cinta adhesiva doble cara con respaldo en ambos lados de modo que coincida con el tamaño del portaobjetos de cuarzo utilizado para armar la cámara de flujo. Marque la posición de los orificios para los tubos en la cinta con un lápiz para poder dibujar un contorno de la cámara de flujo sobre la cinta. Después de marcar los orificios, haga un rectángulo de dos milímetros de ancho alrededor de las marcas.

Este rectángulo servirá como canal de flujo, por lo que asegúrese de hacer lados rectos y dejar espacio alrededor de la entrada y salida del tubo. Ahora corte la cinta marcada siguiendo el contorno dibujado, realizando cortes rectos y limpios para garantizar que ningún adhesivo sobresalga hacia el canal. Limpie cuidadosamente la lámina de cuarzo utilizando acetona para eliminar el adhesivo proveniente de la construcción de la celda de flujo utilizada en experimentos anteriores.

Encuentre la mejor alineación del contorno del canal. Retire un lado del respaldo adhesivo y coloque cuidadosamente la cinta sobre la portaobjetos. Tenga cuidado de alinear correctamente la cinta, ya que los orificios de entrada y salida deben permanecer desbloqueados.

A continuación, prepare trozos de tubo de 0,76 milímetros de longitud para la entrada y salida de la celda de flujo. Es útil cortar el extremo del tubo con un ángulo de aproximadamente 30 grados para que el tubo no quede plano contra el fondo de la cámara. Sujete los tubos en gradillas para tubos de ensayo para facilitar su conexión a la celda de flujo en los siguientes pasos.

Hasta ahora, la incubación del cubreobjetos ha finalizado. Enjuague bien el cubreobjetos recubierto con strep avid ENC con agua y séquelo utilizando aire comprimido. Tenga cuidado de no dar la vuelta al cubreobjetos, ya que solo un lado está funcionalizado.

Finalmente, complete el ensamblaje de la cámara de flujo retirando el otro lado del respaldo adhesivo y colocando el portaobjetos de cuarzo sobre el cubreobjetos. Presione ligeramente el cubreobjetos para expulsar cualquier aire atrapado en el adhesivo. Esto ayudará a prevenir que se formen burbujas de aire en el canal de flujo.

Selle los lados de la cámara con epoxi. Inserte el tubo cortado en los orificios del cuarzo y séllelo con epoxi; deje secar durante unos minutos. Cuando el sellado con epoxi esté seco, comience el bloqueo de la superficie.

Utilizando una aguja de 21 gauge. Aspire un poco del tampón de bloqueo Degas a través de uno de los tubos. Lave varias veces para eliminar las burbujas de aire y deje que la cámara incube durante al menos media hora antes de pasar al experimento de replicación de molécula individual.

Ahora que la celda de flujo ha sido bloqueada, colóquela sobre la platina del microscopio. Sujete la cámara en su lugar con pinzas de la platina y asegúrese de que el canal de flujo esté alineado a lo largo del eje y. Conecte el tubo de salida de la celda de flujo a la bomba de jeringa utilizando un tubo conector de mayor diámetro.

Coloque la entrada en tampón de bloqueo y tire suavemente del émbolo de la jeringa para eliminar cualquier aire presente en el tubo. Un ligero golpe en el tubo de salida ayudará a eliminar las burbujas de aire atrapadas en la celda de flujo. A continuación, agregue el ADN, diluya la plantilla de ADN stock hasta 25 picomolares en un mililitro de tampón de bloqueo y hágala fluir hacia la cámara a un flujo moderado, como 0,025 mililitros por minuto durante 30 minutos, para permitir una buena cobertura superficial del ADN.

Una vez que el ADN esté en la cámara, elimine el exceso de ADN mediante un lavado con tampón bloqueante durante al menos 200 volúmenes de la celda de flujo. Para eliminar todo el ADN libre, encienda el láser y la cámara. El CCD refrigerado debe alcanzar la temperatura adecuada antes de poder utilizarse.

Después de eliminar el exceso de ADN y desgasificar el tampón de replicación, prepare la mezcla de reacción de replicación con nucleótidos, DTT y citoxina en el tampón de replicación. A continuación, agregue las proteínas y mezcle suavemente. Luego, haga fluir la mezcla de reacción dentro de la celda de flujo.

La velocidad del flujo aquí debe ser suficiente para estirar el ADN de doble cadena en un canal de flujo de dos milímetros de ancho y 100 micrómetros de alto; 0,04 mililitros por minuto funciona bien. Deje tiempo para que la mezcla entre en la cámara, aproximadamente 10 minutos.

Mueva el campo de visión hacia el lateral del canal y enfoque el material adhesivo para asegurarse de que está cerca de la superficie antes de enfocar y comenzar la adquisición de imágenes. Ajuste la potencia del láser, el enfoque del microscopio y el ángulo del césped. Mantenga la potencia baja para evitar cualquier escisión por fotoablation del ADN marcado.

Adquiera de uno a cinco cuadros por segundo durante varios minutos, dependiendo de la velocidad de replicación del ADN. Repita el proceso para obtener trayectorias de replicación más largas o muévase a un nuevo campo para observar más moléculas cuando casi toda la mezcla de reacción haya sido impulsada hacia la célula; agregue más tampón con cit para visualizar otros campos de observación. Tomar múltiples imágenes de diferentes moléculas replicadas proporciona estadísticas para la determinación de la productividad.

En el círculo de rodadura. En el ensayo de replicación, la síntesis de la hebra conductora extiende la cola que une el círculo y la superficie; luego, la cola se convierte en ADN bicatenario mediante la polimerasa de la hebra rezagada y se estira por flujo laminar, como se muestra. A continuación se presenta un ejemplo de campo de visión con citrino de naranja con excitación a 532 nanómetros.

Los pequeños puntos fluorescentes son sustratos anclados no replicados. Observe la longitud extrema de los productos y el gran número de productos por campo. Un campo típico mostrará numerosas moléculas en replicación visibles como líneas brillantes alargadas de ADN teñido. Los experimentos con E. coli a 37 grados Celsius producen de cinco a cincuenta moléculas por campo, dependiendo de la densidad superficial.

La zona de replicación de T7 inicia mucho más eficientemente y replicará más del 50 % de las moléculas en un campo. Con una densidad tan alta, es difícil resolver moléculas individuales como se observa aquí. Por lo tanto, realice el experimento con T7 a concentraciones de proteína más bajas o a menor densidad superficial. Los gráficos Chime de moléculas replicantes típicas provenientes de experimentos con E. coli y T7 incluyen trayectorias finales de moléculas de E. coli y T7 trazadas en función del tiempo. Las trayectorias se ajustan mediante regresión lineal para obtener tasas de replicación, que en este ejemplo son de 467,1 pares de bases por segundo para E. coli y 99,4 pares de bases por segundo para T7.

Para T7, las distribuciones de tasas de trayectorias de moléculas individuales ajustadas con gaussianas individuales dan una media de 535,5 ± 39 pares de bases por segundo para E. coli y 75,9 ± 4,8 pares de bases por segundo. Para T7, las distribuciones de longitudes de los productos de replicación se ajustan con una descomposición exponencial simple para obtener la productividad, que es de 85,3 ± 6,1 kilopares de bases para E. coli y 25,3 ± 1,7 kilopares de bases para G7. A continuación, les hemos mostrado cómo medir la replicación coordinada del ADN con moléculas individuales.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar funcionalizar adecuadamente las laminillas y crear canales de flujo limpios y rectos. Asegúrese de mantener baja la potencia del láser y minimizar la fotoclisis del ADN de larga longitud. Eso es todo.

Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.