La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

Este video demuestra un protocolo para visualizar la replicación del ADN mediante microscopía óptica de campo amplio utilizando ADN linealizado y químicamente modificado de fago lambda. El ADN se une a una cubreobjetos de vidrio funcionalizada. El extremo libre del ADN se marca con una perla y el ADN se estira mediante flujo laminar.

Cuando se inicia la replicación, la hebra conductora comienza a alargarse y la hebra rezagada se acorta debido al enrollamiento. La gran diferencia de longitud entre el ADN de doble cadena y el de cadena sencilla a fuerzas bajas permite la observación directa de las conversiones del ADN durante la replicación. La longitud del constructo de ADN se monitorea mediante el seguimiento de la posición del corpúsculo, lo que permite determinar con precisión la velocidad y el proceso de replicación del ADN.

Hola, soy Ari Ulrich de los Laboratorios de Anto uno Vanian y Charles Richardson del Departamento de Química Biológica y Farmacología Molecular de la Escuela de Medicina de Harvard. Hoy les mostraremos un procedimiento para obtener imágenes de la replicación del ADN a nivel molecular individual. Utilizamos este procedimiento en nuestros laboratorios para estudiar las actividades enzimáticas que ocurren durante la síntesis de ADN.

Entonces, comencemos. Al inicio de este procedimiento, el ADN bacteriano linealizado del fago Lambda se modifica mediante oligonucleótidos doblados para formar una horquilla de replicación, un brazo de horquilla complementario a Lambda, un brazo de horquilla biotinilado y un cebador de horquilla. El brazo de horquilla biotinilado contiene una biotina t unida a su extremo 5', lo que permite la fijación de la plantilla de ADN a la superficie de la celda de flujo.

El ADN lambda se modifica adicionalmente mediante hibridación con otro oligonucleótido que contiene un resto de digoxigenina, que sirve como etiqueta inmunológica de alta afinidad para la fijación de una perla. Para generar la horquilla de replicación, obtenga ADN lambda junto con varios oligonucleótidos cuyas secuencias se encuentran en el protocolo escrito que acompaña a este video. Estos oligonucleótidos incluyen un brazo de horquilla biotinilado, un brazo de horquilla complementario al lambda, un cebador de horquilla y un extremo de digoxigenina complementario al lambda; fosforile los extremos cinco primos del brazo de horquilla complementario al lambda y del extremo complementario al lambda que contiene digoxigenina utilizando la polinucleótido cinasa T4.

A continuación, mezcle el brazo de horquilla complementario de lambda fosforilado, el brazo de horquilla biotinilado, el cebador de horquilla y el ADN lambda en una proporción molar de 10 a 10 a 100 a uno. En tampón de la ligasa de ADN T4, caliente la mezcla a 65 grados Celsius durante cinco minutos y enfríe lentamente hasta la temperatura ambiente apagando el bloque térmico, para permitir el apareamiento adecuado de los oligonucleótidos y la ligasa de ADN T4 a la mezcla, e incube durante dos horas. A temperatura ambiente, la ligasa de ADN T4 catalizará el sellado de las muescas entre los oligonucleótidos y el lambda.

Finalmente, anile el diggen complementario lambda y el extremo a la plantilla de replicación de ADN añadiendo el diggen complementario lambda fosforilado y el extremo en tampón de Ligasa T4, incube la mezcla durante 30 minutos a 45 grados Celsius y, nuevamente, enfríe lentamente hasta la temperatura ambiente apagando el bloque térmico. Ligue el diggen complementario lambda fosforilado y el extremo al oxígeno a la plantilla de replicación de ADN añadiendo la ligasa T4 de ADN a la mezcla e incube durante dos horas a temperatura ambiente. La plantilla final de replicación de ADN ya está lista para su uso. Con el fin de unir las perlas magnéticas activadas con borla a la plantilla de replicación de ADN, deben ser funcionalizadas con un fragmento FAB específico para digoxígenina.

Para comenzar este proceso, resuspenda la solución stock de perlas y transfiera 400 microlitros a un tubo einor. Coloque el tubo en un separador magnético e incube hasta que la solución se aclare. Luego, retire el sobrenadante mediante pipeteo. Para activar los grupos toal para el acoplamiento de anticuerpos, agregue un mililitro de buffer boid y mezcle suavemente por pipeteo.

Nuevamente, retire el sobrenadante con la ayuda de un separador magnético. A continuación, agregue 240 microlitros de fragmento FAB y resuspenda los perlas en 400 microlitros de tampón de borato. Mezcle bien y deje incubar en un rotador durante 16 a 24 horas a 37 grados Celsius.

Después de la incubación, separen las perlas utilizando el separador magnético y eliminen el sobrenadante. Laven las perlas con un mililitro de tampón de lavado e incuben durante cinco minutos a cuatro grados Celsius; luego, eliminen el tampón utilizando el separador magnético. Este lavado se repite dos veces.

Para bloquear los grupos tosil libres, agregue un mililitro de BSA que contenga tampón tris e incube durante cuatro horas a 37 grados Celsius. Después de la incubación, retire el tampón de las perlas utilizando un separador magnético, lave dos veces con tampón y alícuota. Para su uso, el ADN que se va a replicar se une a cubreobjetos de vidrio funcionalizados con Amil lane.

El grupo oxígeno del Amil lane se une al vidrio, dejando un amin disponible para la unión con moléculas de peg biotiniladas. Este recubrimiento ayuda a reducir la unión no específica a la superficie. Para limpiar completamente las laminillas de vidrio, colóquelas en frascos de tinción y llene los frascos con etanol, sometiéndolos a sonicación.

Durante 30 minutos, enjuague los frascos y llénelos con sonicación de hidróxido de potasio uno molar durante 30 minutos y repita ambos lavados. Para la primera reacción de funcionalización, es necesario eliminar todos los rastros de agua. Llene los frascos de tinción con acetona y someta a sonicación durante 10 minutos.

Vacíe los frascos y llénelos nuevamente con acetona. Proceda a agregar el reactivo sine a los frascos y agite durante dos minutos. Luego, detenga la reacción con un gran exceso de agua.

Luego, seque las laminillas horneándolas a 110 grados Celsius durante 30 minutos. A continuación, prepare la mezcla de peg alrededor del 0,2 % peso por volumen. El peg biotinilado, incluyendo un espaciador de laminilla de vidrio, permitirá la separación de las laminillas; pipetee 100 microlitros sobre una laminilla silanizada seca.

Coloque un segundo cubreobjetos encima. Incube los cubreobjetos en la solución de PEG durante tres horas. Luego, separe cada par de cubreobjetos y lávelos extensamente con agua.

Tenga cuidado de mantener los cubreobjetos con el lado funcionalizado hacia arriba, ya que solo un lado estará recubierto con peg. Finalmente, seque los cubreobjetos con aire comprimido y guárdelos al vacío en un desecador; las superficies permanecen estables durante al menos un mes. Por lo tanto, se pueden fabricar docenas de cubreobjetos en un lote y utilizarlos según sea necesario.

Ahora que los cubreobjetos están listos, se puede armar la cámara de flujo para el experimento de molécula individual. El experimento de molécula individual se realiza utilizando una cámara de flujo sencilla construida con un cubreobjetos funcionalizado, cinta adhesiva doble cara, una placa de cuarzo y tubos. Se prepara una cámara de flujo para cada experimento de molécula individual.

Comience mezclando cinco mililitros de tampón bloqueante y 20 mililitros de tampón de trabajo, y coloque la mezcla en un desecador para eliminar cualquier burbuja de aire en pasos posteriores. A continuación, extienda 100 microlitros de una solución de trabajo de strp din en PBS sobre la superficie del cubreobjetos funcionalizado con PEG, incube durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir que el strp din se una a la biotina superficial. Mientras tanto, corte un trozo de cinta de doble cara para que coincida con el tamaño del portaobjetos de cuarzo y marque la posición de los orificios del tubo en la cinta.

Delinee la cámara de flujo dibujando un canal central de tres milímetros de ancho y rectángulos que contengan ambos orificios. Las cámaras de flujo pueden diseñarse con dos canales de entrada y dos de salida con forma de y. Ahora corte la cinta marcada siguiendo el contorno dibujado, realizando cortes rectos y limpios para asegurarse de que ningún adhesivo sobresalga hacia el interior del canal.

Limpie minuciosamente la lámina de cuarzo utilizando acetona para eliminar el adhesivo de la construcción de la celda de flujo usada en experimentos previos. Encuentre la mejor alineación del contorno del canal. Retire un lado del respaldo adhesivo y coloque cuidadosamente la cinta sobre la lámina de cuarzo.

Tenga cuidado de alinear adecuadamente la cinta, ya que los orificios de entrada y salida deben permanecer despejados. A continuación, prepare trozos de tubo cortados de tubo con diámetro interno de 0,76 milímetros para la entrada y salida de la celda de flujo. Corte el extremo del tubo en un ángulo de aproximadamente 30 grados para que el tubo no quede aplastado contra el fondo de la cámara.

Suspenda el tubo en gradillas para tubos de ensayo para facilitar su fijación a la celda de flujo en los siguientes pasos. Para este momento, la incubación del cubreobjetos ya debería haber finalizado. Enjuague bien el cubreobjetos con agua y séquelo utilizando aire comprimido.

Tenga cuidado de no dar vuelta la cubreobjetos, ya que solo un lado está funcionalizado con peg. Complete el ensamblaje de la cámara de flujo retirando el otro lado del respaldo adhesivo y colocando el portaobjetos de cuarzo sobre la cubreobjetos. Presione ligeramente la cubreobjetos para expulsar cualquier aire atrapado en el adhesivo. Esto ayudará a prevenir que se formen burbujas de aire en el canal de flujo.

Selle los lados de la cámara con epoxi. Inserte el tubo cortado en los orificios del cuarzo y séllelo en su lugar con el epoxi. Deje secar durante unos minutos.

Una vez secos, utilice una aguja de calibre 21 para extraer algo del tampón bloqueante de DGAs a través de uno de los tubos con el fin de bloquear la superficie de la cámara. Lave varias veces para eliminar las burbujas de aire y deje que la cámara incube durante al menos 30 minutos antes de pasar al experimento de replicación de molécula individual. Una vez que se hayan preparado las perlas funcionalizadas con la plantilla de ADN y la cámara de flujo, se puede realizar un experimento de molécula individual.

Para comenzar, coloque la celda de flujo sobre la platina del microscopio. Sujete la cámara en su lugar con las pinzas de la platina y asegúrese de que el canal de flujo esté alineado con la cámara CCD. Conecte el sistema de aire previamente construido a la bomba de jeringa y a los tubos de salida de la celda de flujo.

Utilizando tubos conectores de mayor diámetro, coloque los tubos de entrada de la celda de flujo en tampón de bloqueo y tire suavemente del émbolo de la jeringa para extraer cualquier burbuja de aire de los tubos; sacuda ligeramente los tubos de salida para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la celda de flujo. Una vez eliminadas todas las burbujas de aire, tape uno de los tubos de entrada con una aguja y selle uno de los tubos de salida doblando este último 180 grados y fijándolo con cinta adhesiva. Antes de añadir el ADN a la celda, diluya la plantilla de ADN almacenada hasta 10 picomolares en un mililitro de tampón de bloqueo DGAs uno x. Pase la plantilla a través de la cámara a un flujo moderado para permitir una buena cobertura superficial del ADN.

Diluya la solución stock de perlas a entre dos y cuatro veces 10 a la sexta perlas por mililitro. En un mililitro de DGAs, agregue un bloqueante x. Luego, vortexee la mezcla y sométala a ultrasonido durante 20 segundos.

Fluya la solución diluida de perlas hacia la cámara. Una vez añadidas las perlas, detenga el flujo y permita que la cámara alcance el equilibrio. A continuación, cierre ambos tubos de salida.

Cualquier cambio en los tubos sin que la cámara esté cerrada provocará fluctuaciones de presión que ejercerán una fuerza considerable sobre los microesferas y romperán las moléculas de ADN ancladas. Tape el tubo de entrada utilizado para cargar las microesferas con una aguja utilizando el segundo tubo de entrada. Comience a lavar la celda de flujo con DGAs una solución al 1x de tampón de bloqueo, lavando exhaustivamente.

Agite la platina golpeándola suavemente para eliminar cualquier perla que esté adherida no específicamente a la superficie y compruebe esto. Las perlas están unidas al ADN. Intente cambiar la dirección del flujo.

Una vez que se hayan eliminado suficientemente las perlas libres, detenga el flujo y permita que la cámara alcance el equilibrio. Prepare una mezcla de reacción fresca que contenga las proteínas de replicación según se indica en el protocolo del texto. Cierre el tubo de salida abierto y cambie el depósito de entrada a la mezcla de reacción recién preparada.

Abra lentamente la salida para evitar cambios bruscos de presión y continuar con la reacción enzimática. Primero, haga fluir la solución proteica hacia la cámara a un flujo moderado para permitir una unión eficiente al ADN. Detenga el flujo y permita que la cámara alcance el equilibrio.

Cierre los tubos de salida y reemplace el tubo que contiene la mezcla de reacción. Con el tubo que contiene tampón de lavado DGA, lave la cámara para eliminar las proteínas libres tras el lavado. Nuevamente, detenga el flujo y permita que la cámara alcance el equilibrio.

Cierre los tubos de salida y reemplace el tubo que contiene el tampón de lavado. Con el tubo que contiene el tampón de replicación T7, el tampón de replicación T7 contiene cloruro de magnesio que desencadena el inicio de la reacción de replicación. Utilice un caudal de 0,012 mililitros por minuto, lo que equivale a una fuerza de arrastre de tres picoNewtons sobre los anclajes de ADN, usando las condiciones descritas en este protocolo.

Coloque un imán permanente de tierras raras sobre la celda de flujo antes de la imagen para evitar interacciones no específicas entre las perlas y la superficie. Coloque un iluminador de fibra en un ángulo de incidencia entre 10 grados y paralelo al plano del microscopio cerca del campo de visión del microscopio con un objetivo de 10 x y una cámara CCD. Se utiliza iluminación en campo oscuro para aumentar el contraste en el enfoque de imagen de las perlas mediante una perla anclada.

Comience la adquisición de datos durante 20 a 30 minutos a una velocidad de fotogramas lenta. En un experimento exitoso, se pueden observar simultáneamente 100 perlas. El experimento debe producir numerosos trazos que muestren la síntesis de la cadena conductora de ADN.

Con el fin de medir las tasas y la procesividad del desenrollamiento del ADN y de la polimerización, es necesario determinar las posiciones precisas de las perlas para lograrlo. Ajuste estas posiciones con funciones gaussianas bidimensionales. Visualice la trayectoria rastreando la posición de la perla en cada cuadro mediante software de seguimiento.

Luego represente gráficamente la posición del gránulo en función del tiempo utilizando cualquier software gráfico para obtener los datos de velocidad. Ajuste las gráficas mediante una regresión lineal y calcule la pendiente para el movimiento progresivo. Determine la longitud total del ADN desde el inicio hasta el final de un evento de acortamiento.

Combine todas las mediciones individuales y represente gráficamente las distribuciones de velocidad y productividad, ajustando los datos mediante funciones gaussianas y exponenciales simples, respectivamente. Acabamos de mostrarle cómo medir las velocidades y la procesividad de la replicación del ADN a nivel de molécula individual. Al realizar este procedimiento, es importante asegurarse de que la fuerza y el arrastre ejercidos por el flujo laminar no afecten las actividades enzimáticas de las proteínas de replicación.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y diviértanse en sus experimentos.