Microfluídica digitales para el procesamiento automatizado de Proteómica

La proteómica clínica es una disciplina nueva e importante que promete el descubrimiento de biomarcadores útiles para el diagnóstico y pronóstico tempranos de enfermedades. Aquí presentamos un nuevo método de microfluídica digital o DMF que integra varios pasos de procesamiento utilizados en proteómica clínica, incluyendo la extracción de proteínas, redisolución, reducción, alquilación y digestión enzimática. La DMF utiliza microgotas discretas de proteínas de muestra sobre una matriz de electrodos y puede operarse a temperatura ambiente, lo que permite el análisis automatizado y paralelo de muestras.

Esta metodología representa un avance significativo con respecto a los métodos convencionales y tiene el potencial de convertirse en una herramienta nueva y útil en proteómica clínica. Hola, soy Steve Sche del laboratorio de la profesora Erin Wheeler del Departamento de Química y del Instituto de Biomateriales e Ingeniería Biomédica de la Universidad de Toronto. Hola, soy Gabriel del Laboratorio Wheeler de la Universidad de Toronto.

Y yo soy Vivian Luke, también del laboratorio Wearer en la Universidad de Toronto. Soy Erin Wheeler. Tengo la fortuna de trabajar con Steve Mace y Vivian.

Hoy les mostraremos un procedimiento para el procesamiento proteómico utilizando microfluídica digital. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar proteínas y muestras biológicas. Así que comencemos.

Comience el procedimiento en la campana extractora limpiando los sustratos de vidrio con solución de piraña. Mientras usa protección adecuada, la solución de piraña se compone de tres partes de ácido sulfúrico concentrado por una parte de peróxido de hidrógeno al 30%. Por lo tanto, se debe tener cuidado al trabajar con ella.

Incube los sustratos de vidrio en piranha durante 10 minutos y, tras la limpieza, enjuáguelos con agua desionizada o desionizada y seque los sustratos con gas nitrógeno. Coloque los sustratos dentro de la cámara de evaporación por haz de electrones para la deposición de cromo hasta un espesor de 250 nanómetros. Retire los sustratos de la cámara una vez alcanzado este espesor y enjuáguelos con isopropanol, luego séquelos en una placa calefactora durante cinco minutos a 115 grados Celsius.

Prime los sustratos secos con hexametilxilazina o HMDS mediante recubrimiento por centrifugado durante 30 segundos. Vuelva a centrifugar a 3000 RPM con el fotoresistente Shipley S 1811 utilizando parámetros idénticos.

Precaliente el sustrato directamente sobre una placa caliente a 100 grados Celsius durante minutos. Luego, patronee la resistencia fotosensible mediante exposición a radiación ultravioleta o UV durante cinco segundos a través de una máscara fotográfica. A continuación, revele los sustratos expuestos a UV en desarrollador Shipley MF 3 21, suficiente para sumergir el sustrato durante tres minutos después.

Lave el sustrato con agua desionizada después. Sometalo directamente a cocción en una placa caliente a 100 grados Celsius durante un minuto. Ataque el cromo expuesto sumergiendo los sustratos durante 30 segundos en suficiente solución de ataque para cromo como para cubrirlos completamente.

Lave los sustratos con agua DI e inmérjalos en un desechador Z 300 T suficiente para sumergir el sustrato durante 10 minutos, con el fin de eliminar la resistencia fotolitográfica residual. Enjuague con agua DI y seque con gas de nitrógeno.

Tras este depósito, dos a cinco micrómetros de Paraline C.A. un polímero aislante sobre el sustrato mediante deposición química de vapor, depositar 50 nanómetros de Teflon AF para hacer que la superficie sea hidrofóbica mediante recubrimiento por centrifugación de una solución al 1% en peso en Fluroinerte FC 40 a 2000 RPM durante 60 segundos sobre el sustrato.

Repita con un sustrato de óxido de indio y estaño sin recubrir o vidrio ITO para crear el poste superior. Incube ambos sustratos en una placa calefactora a 160 grados Celsius durante 10 minutos para montar el dispositivo de microfluídica digital.

Elimine los recubrimientos poliméricos de las almohadillas de contacto de un sustrato inferior raspando con un escalpelo. Conecte las almohadillas expuestas del sustrato inferior con conectores de 40 pines y encienda una computadora que ejecuta LabVIEW. Utilizamos una caja de control construida en casa que contiene relés con señales controladas por un dpad.

La caja de control por computadora facilita el control del usuario sobre la aplicación de 100 voltios RMS por señales de 18 kilohercios al dispositivo mediante los conectores de 40 pines. Encienda también un generador de funciones y un amplificador. Arme el dispositivo colocando dos trozos de cinta adhesiva doble cara de 140 micrómetros de espesor total en los bordes del sustrato inferior.

Pipetee cuatro microlitros de agua desionizada en uno de los depósitos y cierre el dispositivo colocando la lámina de óxido de indio y estaño sin patrón encima del dispositivo, con el lado recubierto de teflón hacia abajo. Conecte un conector a tierra a la placa superior. El programa de inicialización creado en el laboratorio en LabVIEW sirve para calibrar el control de retroalimentación; el dispositivo ya está listo para los experimentos.

En este protocolo, utilizaremos albúmina sérica bovina o BSA como muestra proteica para demostrar el diseño y uso de nuestra microfluídica digital. La BSA se diluye en tampón de trabajo o WB compuesto de tris HCl 100 milimolar pH 7,8 con 0,08 % de F127 en peso por volumen. Prepare un mililitro de cada solución de muestra y reactivo, y etiquete el reservorio al que será añadido.

Tras la preparación del reactivo, retire la placa superior del dispositivo y pipetee cuatro microlitros de solución en el reservorio asignado. Después de llenar los reservorios, vuelva a colocar la placa superior en el dispositivo. Utilice el programa de visualización del laboratorio interno para ejecutar los siguientes pasos.

Recuerde, la interfaz informática permite al usuario dispensar gotas de aproximadamente 600 nanolitros desde los depósitos y manipular las gotas sobre la matriz de electrodos. En primer lugar, dispense una gota de muestra que contenga proteína desde R uno y una gota de precipitante desde R dos. Combine las dos gotas y permita que la gota combinada incube durante cinco minutos para que las proteínas precipiten sobre la superficie.

Actúe sobre el sobrenadante alejándolo de la proteína precipitada hacia el depósito de desecho. Para lavar la proteína precipitada, repita tres veces: dispense tres gotas de tampón de lavado desde R cuatro y muévalas a través de la proteína precipitada hacia el depósito de desecho. Deje secar el precipitado y dispense una gota de tampón resolubilizante desde R cinco sobre la proteína.

Deje que el tampón incube durante 20 minutos hasta que el precipitado se disuelva. A continuación, dispense una gota del agente reductor del recipiente R seis y combínela con la gota de muestra. Mezcle la gota combinada actuando sobre ella a través de seis electrodos en un patrón circular.

Deje que la gota incube durante una hora a temperatura ambiente. Dispense una gota de agente alquilante del R siete y mézclela con la gota de muestra, seguido de mezclado. Deje que la gota incube durante 15 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz.

Finalmente, dispense una gota de tripsina del pocillo R8 y combínela con la gota de muestra, seguido de mezclado. Deje que la gota incube durante tres horas a 37 grados Celsius en una placa de Petri sobre una placa calefactora. Para finalizar la reacción, retire la placa superior y detenga la digestión mediante pipeteo.

Coloque 0,6 mL de ácido tricloroacético al 2,5 % en agua sobre la gota de reacción. Purifique el producto de reacción finalizado mediante sifonado de la gota de muestra directamente desde la placa inferior. Utilizando una punta C 18 tipo zip, según las instrucciones del fabricante, las muestras pueden diluirse ahora según sea necesario y evaluarse mediante espectrometría de masas para identificar las proteínas en la muestra utilizando este sistema.

Posteriormente, las proteínas identificadas mediante espectrometría de masas presentaron puntuaciones de probabilidad inferiores a uno por E a la menos tres, lo que equivale a un intervalo de confianza del 99,9 % y coberturas de secuencia de al menos el 30 %. Por lo tanto, la metodología DMF es muy útil para el procesamiento automatizado de muestras proteómicas. Hoy simplemente hemos mostrado cómo utilizamos la microfluídica digital para extraer y procesar proteínas de forma automatizada. Esta metodología proporciona una solución potencial para la pérdida de muestras y la contaminación durante el aislamiento y la identificación de proteínas.

Esperamos aplicar este método en el futuro a otras aplicaciones biológicas, incluyendo inmunoensayos y ensayos basados en células. Al realizar este tipo de experimento, lo más importante es recordar disfrutarlo. Así que esto es todo.

Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.