Un rápido de alto rendimiento para el método de asignación de Ribonucleoproteínas (RNP) de Derechos Humanos pre-mRNA

Para mapear los sitios de unión de las proteínas ribonucleares en preARNs, comience por cubrir la región designada del preARN de interés en ventanas de 30 nucleótidos y sintetice los oligos dispuestos en un arreglo. Los oligos se separan por ebullición del arreglo y se precipitan conjuntamente con un RNP de interés. El conjunto total inicial se marca con SCI tres y el conjunto unido se marca con SCI cinco, y ambos se aplican al arreglo de detección.

Posteriormente, se escanea la matriz y se utiliza un software de extracción de características para interpretar los resultados. Sales. Hola, soy Kate Watkins del laboratorio de Will Fair brother en el Departamento de MCB de la Universidad de Brown. Hoy les mostraré un procedimiento rápido y económico para determinar la ubicación precisa de un complejo proteína ARN sobre un ARN previo en el laboratorio, resintetizando el ARN previo como un conjunto de oligonucleótidos superpuestos.

Este grupo puede luego separarse en una fracción unida y otra no unida mediante coinmunoprecipitación y posteriormente analizarse mediante un microarreglo. Aunque este procedimiento tiene muchas aplicaciones, lo utilizamos para estudiar múltiples factores de empalme y su papel en el empalme alternativo. Comencemos, pues.

Para comenzar este procedimiento, utilice el navegador genómico uc SC para descargar genes específicos, uniones de empalme u otras regiones de interés a partir de las cuales diseñar el grupo prem A. Seleccione las ventanas de interés y luego coloque mosaicos computacionalmente sobre ellas con una longitud de lectura de 30 nucleótidos y un traslape de 20 nucleótidos, de modo que cada oligonucleótido se desplace 10 nucleótidos respecto al anterior. Una vez definidos los oligonucleótidos de 30 nucleótidos de longitud, añada a cada extremo secuencias universales de cebadores.

Envíe los oligonucleótidos a Agilent para su impresión en un microarreglo de oligonucleótidos personalizado. Una vez que llegue el microarreglo, comience a recuperar los oligonucleótidos de ADN de su superficie colocando la cubierta del microarreglo en una cámara de hibridación y pipeteando suavemente 500 microlitros de agua desionizada sobre el portaobjetos. Coloque el portaobjetos del microarreglo boca abajo encima de la cubierta, de modo que las etiquetas de cada portaobjetos queden enfrentadas, y tenga cuidado de evitar burbujas de aire que puedan interrumpir el proceso de recuperación de los oligonucleótidos.

Cierre la cámara de hibridación y rote durante la noche a 99 grados Celsius en un horno de hibridación. Al día siguiente, retire cuidadosamente el microarreglo de la cámara y elimine el agua, que ahora contiene los oligonucleótidos liberados de la superficie del microarreglo. Coloque el grupo de oligonucleótidos liberados en un tubo eppendorf de 1,5 mililitros y sométalo a sonicación para desagregar posibles grumos, con una amplitud del 50 %, tres veces, aplicando pulsos de tres a cinco segundos cada vez. A continuación, amplifique el grupo mediante PCR de bajo número de ciclos utilizando cebadores universales con un promotor T añadido en su extremo.

El número de ciclos requeridos puede variar según la eficiencia de recuperación del oligonucleótido. Evite la sobre amplificación, que es visible como una banda difusa en un gel de acrilamida. Finalmente, utilice el kit mega short script de Amon para transcribir el ARN.

Finalice la reacción de transcripción mediante extracción del ARN con cloroformo fenílico, seguida de precipitación con etanol usando acetato de sodio y también azul de glicerol como portador. Reuspenda el precipitado de ARN en 105 microlitros de tampón TE. Para determinar con precisión la concentración del ARN.

Utilice ribo green para generar una curva estándar. Luego, mida utilizando un lector de placas de fluorescencia. El grupo de ARN ya está listo para comenzar la coinmunoprecipitación y realizar el aislamiento.

Primero, prepare las perlas magnéticas combinando perlas Dyna de proteína A y proteína G en una proporción uno a uno hasta un volumen final de 50 microlitros por reacción. Concentre las perlas en un lugar utilizando un soporte magnético para separación con el fin de eliminar el sobrenadante. Luego lave dos veces con un volumen igual de PBS 1X frío tras el segundo lavado.

Resuspenda las perlas en un volumen igual de PBS 1X frío y agregue dos nanogramos del anticuerpo por alícuota. Esta cantidad puede variar según el anticuerpo, por lo que puede ser necesario realizar experimentos para determinar las condiciones óptimas de unión del anticuerpo a las perlas. Incube la mezcla durante la noche a cuatro grados Celsius en una plataforma rotatoria.

Por la mañana, agregue dos microgramos por reacción de ARN total de levadura sonicado para bloquear la unión inespecífica y rote durante 30 minutos adicionales a cuatro grados Celsius. Una vez finalizado el paso de bloqueo, use nuevamente el soporte magnético para eliminar el sobrenadante. Luego, lave las perlas dos veces con un XPBS frío, dejando el PBS del segundo lavado en el tubo. Aliquote 50 microlitros de la mezcla de perlas en tubos nuevos.

Un tubo para cada reacción de co-inmunoprecipitación. Las perlas ya están listas para la co-inmunoprecipitación. A continuación, prepare la mezcla maestra combinando el grupo de oligonucleótidos de ARN con el extracto nuclear de células.

Como fuente de RNP, tome una alícuota de 50 microlitros de la mezcla maestra como muestra total protegida. Los cebadores, que son versiones de ARN de los cebadores universales, pueden agregarse para evitar la unión de proteínas a la secuencia del cebador o la formación de estructuras secundarias en el ARN. Para iniciar la coinmunoprecipitación, retire el sobrenadante de las alícuotas de perlas y resuspenda las perlas en 120 microlitros de la mezcla maestra restante. Agite suavemente las reacciones a cuatro grados Celsius durante una a dos horas.

Al final de la incubación, se puede retirar una pequeña cantidad de Eloqua, incluyendo las perlas, de cada co-ip. Para pruebas adicionales de eficiencia o especificidad de unión, coloque el resto de las reacciones en el imán y retire el sobrenadante. A continuación, realice uno o dos lavados con XPDS frío.

El ARN unido al anticuerpo en las perlas a través del RNP es la muestra de IP. Re suspenda las perlas de IP en 50 microlitros de SDS al 1 % en tampón 0.1 XTE y caliente las muestras a 65 grados Celsius durante 15 minutos. Para eluir el ARN, retire el sobrenadante, que ahora contiene el ARN previamente unido a las perlas, y limpie mediante extracción con fenol-cloroformo, seguida de una precipitación con etanol; luego, re suspenda el precipitado en 50 microlitros de tampón 0.1 XT.

A continuación, transcriba a la inversa las muestras utilizando los cebadores universales inversos. Luego, amplifique las muestras mediante PCR con los cebadores universales, uno de los cuales debe contener un promotor T siete. El número de ciclos necesario para amplificar el grupo dependerá de la eficiencia de la coip.

Utilizando el kit de guiones cortos mega de Ambion, transcriba las muestras nuevamente, pero esta vez agregue dos microlitros de UTP aminoalilo en lugar del UTP T7 que viene con el kit. El UTP aminoalilo se utilizará posteriormente para marcar el ARN con los side eyes. Cuando la transcripción esté completa.

Extraiga con cloroformo de fenilo y precipite con etanol las muestras. No utilice glicoblue ni acetato de amonio, ya que podrían interferir con la hibridación de las muestras en la matriz. Resuspenda el precipitado en 4,5 microlitros de carbonato de sodio 0,1 molar.

Para etiquetar primero las muestras, agregue 2.5 microlitros de agua libre de nucleasas a la muestra total. Agregue tres microlitros de S3 y a la muestra de IP tres microlitros de SCI cinco. Incube a oscuras durante una hora.

A temperatura ambiente, finalice la reacción añadiendo seis microlitros de hidroxilamina 4 M HCl a cada muestra, mezcle completamente y centrifugue. Incube brevemente durante 15 minutos a temperatura ambiente y purifique las muestras marcadas mediante extracción con fenol-cloroformo, seguida de precipitación con etanol. La mayor parte del color se arrastra a la fase orgánica junto con los nucleótidos libres, por lo que los pellet pueden no estar visiblemente coloreados.

Re-suspender cada pellet en 50 microlitros de 0,1 XTE. Seguir las instrucciones del kit de hibridación de matrices de Agilent para preparar la muestra de microarreglo con la siguiente excepción: no fragmentar el ARN. Después de agregar el tampón de fragmentación, agregar inmediatamente el tampón de hibridación para detener la fragmentación.

Coloque las muestras en la matriz e hibride a 50 grados Celsius durante tres horas mientras la matriz gira. Prepare las siguientes soluciones de 50 mililitros en tubos cónicos de 50 mililitros: un tubo de buffer SC al doble de exceso, dos tubos de buffer marino al exceso simple y un tubo de agua desionizada.

Después de la incubación de tres horas, desmonte con cuidado el portaobjetos del dispositivo y colóquelo en el tampón 2XSSC. Utilizando un par de pinzas, separe suavemente la matriz del cubreobjetos.

Retire suavemente la cubierta, teniendo cuidado de no tocar el microarreglo. Al extraerse el portaobjetos, cierre el tubo cónico e inviértalo suavemente durante 60 segundos. Con la ayuda de la pinza, transfiera el microarreglo a la solución de XSSC 1x.

Tape el tubo e inviértalo suavemente durante un minuto. Luego, transfiera el arreglo a la segunda solución XSSC e inviértalo nuevamente suavemente durante otro minuto. Por último, transfiera el arreglo al tubo con agua desionizada e inviértalo suavemente durante 30 segundos.

Seque el portaobjetos colocando sus bordes sobre una toalla de papel kim. Continúe rotando el portaobjetos sobre la toalla, asegurándose de no alterar el lado que contiene los oligonucleótidos. Coloque el portaobjetos en un tubo cónico vacío y proceda a escanearlo.

Proceda a escanear la matriz. A continuación se muestra una matriz representativa. Cada característica u oligonucleótido está coloreada en verde para el conjunto total no enriquecido o en rojo para el conjunto enriquecido por inmunoprecipitación.

La señal en cada característica se normaliza respecto a la intensidad total en ese canal. El resultado final es el logaritmo de la relación entre el canal rojo y el canal verde. En cada característica de la matriz, el valor promedio en cada coordenada genómica se asigna a la ubicación dada.

Se muestra una ilustración de este paso de promediado para tres oligos de 30 nucleótidos superpuestos con puntuaciones de dos, cuatro y 0,5, donde se indica la puntuación promedio de enriquecimiento para cada ventana de 10 nucleótidos. A continuación se presenta un ejemplo de un esquema de unión de la proteína de unión a secuencias polipiridínicas PTB en el gen CLTA; las características del gen se indican en la parte inferior y las puntuaciones logarítmicas promedio de enriquecimiento para los fragmentos unidos a PTB se representan mediante barras verticales rojo oscuro. Las barras rojo claro muestran las regiones que no están enriquecidas para la unión de PTB.

Acabo de mostrarle cómo crear rápida y eficientemente un grupo de oligonucleótidos que cubre regiones de interés, como exones alternativamente empalmados. Analizamos nuestros grupos mediante microarreglos, aunque también es posible secuenciarlos mediante secuenciación iluminosa, secuenciación Lexi o la secuenciación más tradicional de Sanger. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la creación del grupo puede modificarse tanto a nivel de ARN como a nivel de proteína.

A nivel de ARN, podemos introducir regiones autólogas, mutaciones asociadas a enfermedades, polimorfismos o mutaciones aleatorias en la secuencia de oligonucleótidos. A nivel de proteína, el factor de unión al ARN puede modificarse mediante fosforilación u otras modificaciones postraduccionales. Asimismo, se puede manipular el entorno de unión para aumentar o disminuir los niveles de factores adicionales que compiten o interactúan con la proteína de unión al ARN de interés.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.