Método para el aislamiento e identificación de mRNAs, microRNAs y componentes proteicos de ribonucleoprotein complejos de extractos celulares usando RIP-Chip

El objetivo de este video es demostrar el método para el aislamiento y la identificación de componentes de ARN y proteínas de complejos ribonucleoproteicos a partir de extractos celulares utilizando métodos de inmunoprecipitación. Hola, mi nombre es Garrett Dom y soy estudiante de posgrado en el departamento de Microbiología Molecular e Inmunología de la Universidad de Missouri, estudiando bajo la dirección del Dr. Eli Sso. Gracias a los avances en secuenciación de alto rendimiento y en análisis eficientes mediante microarreglos, el análisis global de la expresión génica se ha convertido en una forma sencilla y ampliamente disponible de recolección de datos en muchos modelos de investigación y enfermedades.

Sin embargo, el estudio de los niveles en estado estacionario del ARNm del gen diana no siempre se correlaciona directamente con los niveles estables de proteína. La regulación génica postranscripcional es una explicación probable de la divergencia entre ambos. Impulsada por las interacciones de las proteínas que se unen al ARN.

La regulación postranscripcional afecta la localización, estabilidad y traducción del ARNm mediante la formación de un complejo ribonucleoproteico con ARNm diana. La identificación de estos ARNm diana Denovo desconocidos a partir de extractos celulares en este complejo es fundamental para comprender los mecanismos y funciones de la proteína de unión al ARN y su efecto resultante en la producción de proteínas. Este protocolo describe un método denominado ribo proteína, inmunoprecipitación inmuno o rip, que permite la identificación de ARNm específicos asociados al complejo ribonucleoproteico.

Antes de comenzar el experimento, es fundamental tener todos los reactivos, recipientes y utensilios. Trate la vidriería libre de ARN con un inhibidor de RNasa, como RNA ZAP de Ambion, seguido de un enjuague con agua tratada con dpci, y asegúrese de que todos los reactivos estén confirmados como libres de ARN. El primer paso del procedimiento consiste en cosechar el complejo de ribonucleoproteína del lisado celular: coseche células de tejido en crecimiento exponencial para producir entre dos y cinco miligramos de proteína total por cada muestra utilizada; normalmente, dos placas de cultivo de 150 mm son suficientes.

Aquí estamos cosechando las líneas celulares de cáncer de mama humano MB 2 31 y MC siete e investigando las interacciones ribonucleoproteicas de la proteína de unión a ARN. Es importante tener en cuenta que, para cada proteína de unión a ARN que se investigue, se deben optimizar el número celular total y las cantidades de proteína para maximizar las interacciones adecuadas entre el ARNm diana y la proteína de unión a ARN. Pelar las células mediante centrifugación a 1000 RPM durante aproximadamente de ocho a 10 minutos a cuatro grados Celsius, luego lavar tres veces con PBS frío con hielo. Después del lavado final, agitar suavemente el fondo del tubo y resuspender el pellet celular en volúmenes iguales del tampón de lisis de polisomas preparado con inhibidores de ARNasas y proteasas.

Se recomienda medir con precisión el volumen exacto del pellet celular, mezclar suavemente con una pipeta para romper los agregados de células e incubar el lisado en hielo durante cinco minutos. Centrifugar a 13.000 ×g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius para eliminar los residuos celulares; inmediatamente, transferir el sobrenadante clarificado a tubos microcéntrifugos de RNAs Free previamente enfriados, mantenerlos en hielo y almacenarlos a menos 80 grados Celsius.

Este lisado puede almacenarse hasta seis meses a menos 80 grados Celsius. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación, ya que esto puede provocar la degradación de proteínas y/o de mRNA. Lo mejor es realizar la IP inmediatamente.

Realice una cuantificación rápida de la concentración de proteína y del lisado utilizando el ensayo estándar de proteína de Bradford. A continuación, necesitaremos preparar los materiales para el aislamiento de nuestra proteína específica de interés. Primero, hincha previamente la proteína.

Incubar perlas Sphero durante toda la noche en tampón NT dos suplementado con BSA al 5 % y almacenar a cuatro grados Celsius. Utilizar el tampón NT dos en una proporción de cuatro a uno con las perlas PAS. Es posible el almacenamiento a largo plazo de hasta varios meses a cuatro grados Celsius.

Cuando se suplementa con azida de sodio al 0,1 % antes del uso, elimine el exceso de tampón NT dos para que la relación final entre perlas y tampón sea uno a uno. Utilizando tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros libres de ARN, retire 100 microlitros de la suspensión SRO y agregue 30 microgramos de anticuerpo para cada reacción individual de IP. Por ejemplo, en nuestro experimento utilizamos un anticuerpo who are, que es un anticuerpo IgG1 de ratón.

Por lo tanto, nuestro anticuerpo de control también es IgG. A continuación, agregue de 100 a 200 microlitros de tampón NT2 a la mezcla de anticuerpo y perlas. Además, se debe usar en paralelo un anticuerpo con isotipo coincidente o suero normal completo de la misma especie como control de anticuerpo frente al ARN de fondo.

Añada el anticuerpo apropiado a la mezcla de perlas e incube toda la noche en agitación por inversión continua a cuatro grados Celsius. Prepare las perlas recubiertas con anticuerpo inmediatamente antes de su uso lavándolas con un mililitro de tampón NT2 frío cinco veces; lave las perlas mediante centrifugación a 13.000 ×g durante uno o dos minutos a cuatro grados. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta manual o un aspirador.

Este lavado ayuda a eliminar el anticuerpo no unido, así como contaminantes de ARN de la mezcla de anticuerpos. Una vez completado el lavado final, resuspenda las perlas en 700 microlitros de tampón T dos frío con hielo, seguido del tratamiento con varios inhibidores de ARN para proteger los ARNm diana, incluyendo 10 microlitros de ARNasa, 10 microlitros de DTT 100 milimolar y 15 microlitros de EDTA. Ajuste el volumen a 900 microlitros con tampón NT dos.

A continuación, inmunoprecipitaremos el complejo diana. Recomendamos encarecidamente utilizar un paso de pre-limpieza para reducir la señal de fondo en su análisis de ARN después del procedimiento de RIP: realice la pre-limpieza con 15 microgramos de control de isotipo durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Añada 50 microlitros de perlas PAS previamente hinchadas no recubiertas con anticuerpo.

Incubar durante 30 minutos a cuatro grados Celsius con rotación y luego centrifugar a 10.000 G a cuatro grados Celsius. Dos veces el pellet. Guardar el sobrenadante para IP.

A continuación, agregue 100 microlitros de lisado clarificado aislado con aproximadamente dos a cinco miligramos de proteína a la mezcla de anticuerpos preparada. Diluir el lisado ayudará a reducir el fondo. Envuelva el tubo con parafina para asegurar un cierre hermético e incube a cuatro grados Celsius durante cuatro horas con agitación suave, luego centrifugue en el próximo paso a 5.000 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y guarde el sobrenadante para posibles análisis almacenándolo a menos 80 grados Celsius según se describió anteriormente. Lave los perlas cinco veces con un mililitro de tampón T2 frío con hielo mediante centrifugación.

Luego, elimine el sobrenadante con una pipeta manual o un aspirador. Pueden utilizarse métodos más rigurosos para reducir el fondo mediante la suplementación del tampón NT2 con desoxicolato de sodio, urea o SDS. Mantenga las muestras en hielo tanto como sea posible y trabaje rápidamente para minimizar la degradación del ARNm diana.

Finalmente, utilizaremos tratamientos con ADNs y proteinasa K seguidos de precipitación de ARN para aislar los ARN de proteínas nucleares ribonucleares tras lavar las perlas resuspendidas con 100 microlitros de tampón N NT dos suplementado con cinco microlitros de ADNs libres de ARNs uno. Mantenga las muestras a 37 grados Celsius durante cinco a 10 minutos. Añada un mililitro de tampón N NT dos y centrifugue a 5.000 G durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante de la proteína Reese centrifugada y el pellet de SROs, y agregue 100 microlitros de tampón NT2 con cinco microlitros de proteinasa K al 10 miligramos por mililitro y un microlitro de SDS al 10%. Incube la mezcla de perlas resuspendidas durante 30 minutos en un baño de agua a 55 grados Celsius, agitando suavemente cada 10 minutos. La proteinasa K facilitará la liberación de los componentes de la ribonucleoproteína. Pellete las perlas.

Agregue 5.000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente, recolecte el sobrenadante, que debe tener un volumen aproximado de 100 microlitros. A continuación, agregue dos perlas, añada 200 microlitros de tampón NT2 y centrifugue a 5.000 G durante dos minutos. Recolecte aproximadamente 200 microlitros de sobrenadante y deseche las perlas.

Combine super natin y agregue 300 microlitros de la capa inferior de fenol ácido. Vortexee durante un minuto a temperatura ambiente y luego centrifugue a velocidad máxima durante un minuto a temperatura ambiente. Recopile 250 microlitros de la capa superior.

Tenga mucho cuidado de no perturbar la interfase, ya que esto causará contaminación. Al muestreo de ARN, añada 25 microlitros de acetato de sodio a pH de 5,2, 625 microlitros de etanol frío al 100 % y cinco microlitros de glicoblú. Mezcle bien y almacene durante la noche a menos 20 grados Celsius.

Además, para asegurar una recuperación adecuada del ARN, la adición de glicoblú aumentará la visibilidad del pellet de ARN al actuar como una molécula transportadora. Al día siguiente, mezcle los tubos invirtiéndolos de tres a cinco veces, luego centrifugue a 12.000 G a cuatro grados Celsius durante 30 minutos y deseche el sobrenadante. Añada un mililitro de etanol al 70 % enfriado al pellet azul y mezcle por inversión o vortex, seguido de centrifugación.

Muestre a 12,000 G a cuatro grados Celsius durante dos minutos. Deseche el sobrenadante y centrifugue a 12,000 G durante un minuto a cuatro grados Celsius. Retire cualquier residuo de etanol al 70 % con una pipeta y seque el precipitado al aire.

Añada temperatura ambiente durante cinco minutos. Volver a suspender en 20 a 40 microlitros de agua libre de ARN y ADN. La muestra ya está lista para la cuantificación mediante espectrometría NanoDrop y aplicaciones posteriores, como la PCR cuantitativa en tiempo real o el análisis de microarreglos después del aislamiento de ARN, microarreglos y PCR cuantitativa en tiempo real, que se realizaron para revelar los blancos de ARNm de la proteína que une ARN who are, y su enriquecimiento resultante a partir de la inmunoprecipitación.

La confirmación mediante blot de Western revela el aislamiento limpio de la proteína diana. La PCR cuantitativa demuestra el enriquecimiento relativo del ARNm diana beta-actina en comparación con los controles de IgG. Aunque el análisis de microarrays revela perfiles genéticos únicos entre las líneas celulares de cáncer de mama MC7 y MB231, la inmunoprecipitación de ribonucleoproteínas se ha establecido como una herramienta excelente utilizada para aislar y estudiar las interacciones entre proteínas que se unen al ARN y sus dianas de ARNm, por parte de nuestro grupo y de muchos otros grupos de investigación. Aunque esta técnica es sensible por naturaleza y en la práctica, su correcta ejecución permitirá el aislamiento de estos complejos de ribonucleoproteínas, que hasta hace poco han sido inaccesibles para el descubrimiento y el análisis.