Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

En este procedimiento, el ARN marcado con fluorescencia. Los transcritos se inyectan en los ocitos de XUS y su localización se monitorea. Primero, el ARN se marca con nucleótidos fluorescentes.

En una reacción de transcripción in vitro, el ARN se carga luego en un aparato de microinyección. Los ovocitos se colocan en una placa de inyección y se microinyectan cuidadosamente. Finalmente, los ovocitos se cultivan para permitir que ocurra la localización del ARN antes de la obtención de imágenes mediante microscopía confocal.

Hola, soy James Gagnan del laboratorio de la Dra. Kimberly Mallory en el Departamento de Biología Molecular, Biología Celular y Bioquímica de la Universidad de Brown. Hoy les mostraremos un procedimiento para visualizar la localización subcelular de ARN en ovocitos de Xap. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la arquitectura del ARN y los factores proteicos necesarios para la localización del ARN durante el desarrollo temprano de los vertebrados.

Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, transcriba el ARNm, que está marcado de forma radiactiva y fluorescente según se describe en el protocolo escrito adjunto. Añada DS para degradar el ADN molde y luego detenga la reacción añadiendo EDTA.

Elimine los nucleótidos no incorporados y otras moléculas pequeñas centrifugando a través de una columna G 50. Luego, se concentra el ARN mediante precipitación con etanol, se lava y se resuspende. Después de determinar la concentración mediante recuento de centelleo, diluya el ARN hasta 50 nanomolar y almacénelo en alícuotas de cinco microlitros a menos 80 grados Celsius.

Cuando esté listo para realizar la microinyección, descongele un Eloqua del ARN marcado y desnature a 70 grados Celsius durante cinco minutos. Luego, centrifugue durante 10 minutos a velocidad máxima en una microcentrífuga a temperatura ambiente para eliminar partículas y mantenga en hielo. A continuación, aísle los cistos, corte trozos de ovario xap post lavu en un cónico de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de tres miligramos por mililitro.

Colagenasa en un tampón de fosfato de potasio 0,1 molar a pH 7,4. Agitar suavemente a 18 grados Celsius debido a la variación entre lotes. El tiempo de tratamiento con colagenasa puede variar y debe monitorearse cuidadosamente mediante inspección visual.

Para asegurar la defoliación, continúe agitando durante 15 minutos o hasta que los ovocitos se separen visiblemente del ovario; permita que los ovocitos sedimenten en el fondo del tubo cónico. Retire la solución y sustitúyala por tampón MBSH. Repita este paso, lavando dos veces más para un total de tres lavados.

A continuación, clasifique manualmente los cistos de estadio tres a cuatro en tampón MBSH bajo un microscopio óptico estándar. Los cistos de estadio tres son completamente opacos, pero de color blanco. Mientras que los cistos de estadio cuatro son ligeramente más grandes y moteados con pigmento.

Los ovocitos que son ligeramente transparentes son demasiado jóvenes y los ovocitos que están completamente pigmentados o presentan una distribución polarizada del pigmento son demasiado viejos. Finalmente, prepare las agujas para la microinyección utilizando capilares de tres pulgadas y media, estirándolos y biselándolos para fabricar agujas con un diámetro externo de aproximadamente 0,05 milímetros. Ahora que los ovocitos con ARNm y las agujas están listos, proceda a la microinyección.

Comience calibrando la aguja con agua desionizada para administrar dos nanómetros por inyección. Cargue la aguja utilizando un microinyector controlado por gas y calibre el tamaño de la gota usando un micrómetro. Después de la calibración, cargue por delante el ARN que se va a inyectar en la aguja. A continuación, coloque los ovocitos clasificados en un platillo de inyección con tampón MBSH; el platillo contiene una capa de espuma de caucho negro.

Los ovocitos blancos se destacan bien sobre un fondo negro. Luego, inyecte cuidadosamente cada ovocito con dos litros de ARN a 50 nanomolares. Asegúrese de inyectar cada ovocito solo una vez y verifique regularmente la aguja en busca de obstrucciones cuando la inyección haya finalizado.

Expulse el ARN restante, enjuague la aguja con agua desionizada y cargue el siguiente ARN para la inyección. Después de la inyección, transfiera los ovocitos inyectados a un pocillo de una placa estéril de 24 pocillos hasta un máximo de mil. Los OVOCITOS pueden cultivarse por pocillo.

Retire el tampón y sustitúyalo con 400 microlitros de medio de cultivo celular por pocillo. Luego, coloque la placa de cultivo dentro de un recipiente de plástico con una toalla de papel húmeda para mantener un ambiente húmedo durante el cultivo, e incube los ovocitos a 18 grados Celsius durante períodos que varían entre ocho y 48 horas tras el período de incubación deseado. Los ovocitos pueden prepararse para microscopía tras la incubación de los ovocitos inyectados.

Separar las ovocélulas muertas y colocar las ovocélulas viables en viales de vidrio. Habitualmente se observa una supervivencia superior al 90 % de las ovocélulas. Reemplazar el tampón con fijador M-E-M-F-A y agitar suavemente las células durante 20 minutos.

Proteja los ovocitos de la luz solar durante la fijación una vez completado el período de fijación. Lave los ovocitos eliminando el fijador y reemplazándolo con un volumen igual de tampón MBSH. Repita este lavado una vez más para un total de dos lavados.

A continuación, lave los ovocitos con metanol anhidro. Primero, retire la mitad del volumen y reemplácelo con metanol. Repita este paso dos veces más.

Después de estos lavados, retire toda la solución y sustitúyala por metanol. Repita este lavado con metanol una vez más. Los ovocitos fijados y deshidratados pueden almacenarse a menos 20 grados Celsius hasta que estén listos para ser analizados mediante imágenes.

Antes de la obtención de imágenes, agregue el medio de aclarado de Marie a un platillo fluoro de fondo de vidrio de WPI para cubrir la superficie de imagen. Transfiera cuidadosamente los ovocitos del metanol al platillo fluoro, minimizando el volumen de metanol transferido. Observe los ovocitos en un microscopio confocal invertido; tanto el Zeiss LSM five 10 como el aica TCSs P ofrecen buenos resultados. Ahora mostraremos algunas imágenes representativas de la localización subcelular de ARN inmediatamente después de la microinyección: se puede observar ARN fluorescente en el núcleo tras ocho horas de cultivo del control marcado con fluorescencia.

El ARN puede observarse distribuido uniformemente en el citoplasma del ovocito. Sin embargo, un ARN marcado con fluorescencia que contiene secuencias capaces de reclutar el mecanismo de transporte puede observarse en proceso de localización subcelular hacia el polo vegetal del ovocito. Acabamos de mostrarle cómo microinyectar ARNs marcados con fluorescencia en ovocitos y observar la localización del ARN mediante microscopía confocal.

Al realizar este procedimiento, es importante utilizar soluciones tratadas con DEPC para evitar la contaminación por ARN en el cultivo, mantener sus citoocitos en OCM que contenga antibióticos y proteger sus citoocitos de la luz solar siempre que sea posible para evitar el blanqueamiento fotográfico. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.