Preparación Individual Drosophila Huevos Cámaras de Imágenes en directo

El objetivo del siguiente experimento es registrar procesos dinámicos en sitios U vivos de drosófila. Esto se logra primero aislado ovarios intactos de moscas hembra de dos días de edad bien alimentadas. Como segundo paso, se extraen folículos individuales de los ovarios para obtener imágenes de las cámaras ovocíticas.

Luego, si expresan una proteína fluorescente adecuada, las cámaras ovulares individuales pueden ser observadas directamente o sometidas a manipulaciones adicionales, como la microinyección de marcadores fluorescentes antes de la observación. En última instancia, mediante el análisis de las secuencias de video, puede revelarse la interacción dinámica de los componentes intracelulares. Este método nos ha ayudado a responder algunas preguntas clave en el campo del transporte de ARN y de la traducción localizada.

Por ejemplo, ¿cómo se regula en el tiempo y en el espacio la expresión de las proteínas que establecen el plan corporal en el organismo vivo? En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque requiere una velocidad y destreza considerables. Con la práctica se obtendrán mejores resultados.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que las manipulaciones de las cámaras ováricas son difíciles de transmitir por escrito y porque se requiere experiencia técnica y manos firmes por parte del operador. Comience este procedimiento colocando una pequeña gota de aceite de halo carbono sobre un cubreobjetos y déjelo aparte. Luego, anestesie las moscas preparadas con dióxido de carbono.

Utilice una pinza fina y afilada para sujetar una mosca hembra grasa en la parte anterior del abdomen. No sujete en el centro del abdomen. Mantenga a la hembra aproximadamente de dos a tres centímetros por encima del cubreobjetos preparado.

Utilizando un segundo par de pinzas, retire el tejido en el extremo posterior de la hembra. Esto generalmente incluirá tejidos intestinales con pinzas limpias. Masajee suavemente el abdomen desde el extremo anterior hasta el posterior, como si se exprimiera pasta dental de un tubo.

Los ovarios tienen el aspecto de estructuras opacas grandes y se adherirán al extremo de la pinza. Recolecte los ovarios tocándolos con el aceite de carbono en halo sobre el portaobjetos. Luego repita el proceso hasta recolectar de cuatro a seis ovarios.

Antes de aislar las estructuras aéreas. Ajuste la fuente de luz del microscopio de manera que la iluminación incida sobre el portaobjetos en un ángulo bajo y genere sombras contrastadas en los tejidos. Al diseccionar las moscas, es muy importante utilizar las herramientas adecuadas.

El puntero que utilizamos no es demasiado afilado para que no dañe el tejido, sino bastante romo para que podamos sujetar las pinzas que usamos. De nuevo, no demasiado afilado para que no dañe los tejidos, pero lo suficientemente fino como para poder manipular las cosas sin doblar la herramienta. También es muy importante tener herramientas limpias, por lo que las limpiamos regularmente durante todo el procedimiento con las pinzas cerradas.

Separe los dos ovarios eliminando el tejido conectivo en el extremo posterior. El extremo posterior contiene las cámaras ovulares más maduras. Oriente un ovario horizontalmente con las cámaras ovulares más jóvenes hacia su mano dominante.

Luego, sostenga suavemente el extremo posterior por el tejido conectivo restante y use una aguja de disección o de tungsteno para separar individualmente los folículos ováricos. Los folículos individuales desde la etapa Jamar hasta la etapa 10 se separarán entre sí, pero los folículos más viejos permanecerán unidos al ovario. Con la aguja, arrastre cuidadosamente de 15 a 25 folículos separados hacia el centro de la gota de aceite. Si es necesario diseccionar más de un ovario, elija uno de una mosca diferente.

Deseche cualquier tejido ovárico excesivo y trabaje rápidamente, ya que los citos comenzarán a mostrar cambios fenotípicos debido al estrés. Después de 40 minutos de haber sido diseccionados del ovario, retire el tejido ovárico excesivo del aceite. Utilizando instrumentos limpios para la inyección de citos en etapa media, oriente los acrílicos perpendicularmente al eje largo del cubreobjetos. Para aislar cámaras de huevo en etapa tardía.

Se requiere un método diferente para agarrar la parte posterior del ovario, como se describió anteriormente. Introduzca la sonda de disección en el extremo posterior del ovario, cerca de la pinza. Para evitar perforar las cámaras de huevos, inserte la sonda entre las cámaras de huevos de estadio tardío.

Extraiga la aguja de disección a través del ovario hasta que salga por las cámaras ováricas en estadio temprano. Cuando se realiza correctamente, la sonda eliminará el tejido conectivo que sostiene en su lugar las estructuras aéreas y las cámaras ováricas en estadio tardío. Repita este paso hasta que las estructuras aéreas queden dispersas sobre el cubreobjetos.

Cuando las cámaras foliculares ya no estén apiladas unas encima de otras, esta etapa habrá finalizado. Utilizando una sonda de disección, separen las cámaras foliculares de estadio tardío para facilitar la obtención de imágenes y posicionar el estadio 14. Para las cámaras del cuello, usen pinzas para sujetar sus apéndices dorsales.

Prepare las soluciones que se inyectarán mediante una breve centrifugación a alta velocidad. Esto sedimentará cualquier depósito sólido que pueda obstruir la aguja de inyección. Luego, cargue la aguja de inyección con una punta de carga y sujete cuidadosamente la aguja cargada al inyector.

Ahora coloque un pequeño trozo de vidrio adyacente a las muestras y monte el portaobjetos sobre la platina del microscopio. El vidrio servirá como una pared para romper o desconectar. Desconecte la aguja.

Prepare el microscopio y el aparato de inyección para el experimento. Tenga cuidado de no romper la punta de la aguja. Si es posible, utilice una platina automatizada con capacidad de visita a puntos para marcar todos los cistos en estadio ocho y estadio nueve para la inyección.

Ahora, baje la aguja de inyección hasta que toque el aceite. Seleccione el primer punto de la lista de puntos marcados y enfoque el citoplasma. Baje manualmente la aguja hasta que quede en el mismo plano de enfoque que el citoplasma.

Utilizando los controles del manipulador, mueva la punta de la aguja de inyección hasta que esté dentro del sitio U. Un movimiento rápido de punción suele ser más exitoso que uno lento. Una vez dentro, expulse un pequeño volumen desde la aguja y evalúe visualmente los efectos.

Se requiere repetición. Si la inyección es exitosa, el citoplasma dentro de la célula será desplazado. Es difícil cuantificar la cantidad exacta de fluido inyectado.

Para aumentar el volumen inyectado, ajuste la presión o la duración del pulso de inyección. Rompa la punta de la aguja para aumentar ligeramente la abertura, o simplemente utilice múltiples pulsos de inyección antes de seleccionar el siguiente cito. Eleve la aguja de inyección lo suficientemente en el aceite para que no choque con otros citos.

Un pinchazo extenso o mantener la aguja dentro del citoplasma daña gravemente la cámara del óvulo. Por lo tanto, actúe con rapidez. La inyección debe tomar menos de 10 segundos.

Si se comete un error, pase a la siguiente marca hacia un sitio. No pierda tiempo en el área dañada a la vista. Cuando la aguja se obstruya, mueva la aguja hacia el fragmento roto de vidrio.

Con el vidrio y la aguja en el mismo plano focal, empuje suavemente la aguja contra el vidrio. Compruebe que la aguja no esté obstruida pulsando el botón de inyección y observando si sale algún líquido por la punta de la aguja. Una vez que se hayan inyectado todos los sitios estadounidenses, retire manualmente la aguja del aceite y colóquela fuera del trayecto del haz del microscopio.

Asegúrese de que esté en una orientación segura para evitar daños oculares y de que las luces estén apagadas. Para facilitar la velocidad de la imagen de fluorescencia, esto es imperativo. Si ha transcurrido una hora o más entre el aislamiento de la cámara de huevo y la inyección de los citos, será difícil inyectar los citos y exhibirán cambios fenotípicos asociados con estrés.

Problemas similares pueden surgir con el manejo brusco del citoplasma o con la inyección de volúmenes excesivos. Se pueden observar cámaras ováricas que expresan proteínas fluorescentes transgénicas sin necesidad de inyección. La marcación con MS2 de ARN endógeno puede visualizarse con buenos resultados utilizando los procedimientos de aislamiento de tejidos junto con el procedimiento completo sintetizado in vitro.

Se inyectó ARN de Alexa, 5 46 kin, en una cámara de huevo ME 31 BGFP; el ARN se localizó en la región anterior dorsal del citoplasma y formó un casquete alrededor del núcleo. Una vez dominada esta técnica, se puede realizar en aproximadamente 10 minutos, desde el momento de la disección hasta el inicio de la adquisición de imágenes. Al intentar este procedimiento, tenga cuidado con el tejido trabajando rápidamente pero con precisión. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo registrar procesos dinámicos en células vivas de Drosophila.