Mosaico transgénesis pez cebra para la evaluación de secuencias potenciadoras

Hola, soy Erica Kgi del laboratorio de Shannon Fisher en el Departamento de Biología Celular y del Desarrollo de la Universidad de Pensilvania. Soy Chris Weber, también del Laboratorio Fisher. Y yo soy Shannon Fisher.

Hoy les mostraremos un procedimiento para analizar la función de elementos potenciadores utilizando la transgénesis en pez cebra. Utilizamos este procedimiento para estudiar la regulación transcripcional de genes importantes en el desarrollo esquelético. Así que comencemos.

Para identificar secuencias no codificantes que rodean genes candidatos, utilizamos el algoritmo fast cons, que está disponible como una pista en el navegador del genoma uc SC. Nuestro principal interés radica en los genes expresados durante el desarrollo esquelético, aunque el mismo enfoque puede emplearse para estudiar cualquier gen expresado durante el desarrollo temprano. En el ejemplo mostrado aquí, hemos identificado secuencias conservadas.

En el intervalo que rodea al gen humano bumper, examinamos todo el intervalo hasta los genes adyacentes y determinamos un valor umbral bajo del logaritmo del puntaje específico para el tamaño, correspondiente aproximadamente al 5 % superior de la secuencia no codificante. Tras seleccionar las secuencias, diseñe cebadores utilizando primer three para amplificar cada secuencia a partir del ADN genómico humano; los cebadores deben elegirse para amplificar la región conservada más 30 o más pares de bases en cada extremo. Amplifique la región de interés con una polimerasa de alta calidad utilizando ADN genómico humano, y emplee procedimientos estándar de biología molecular en el laboratorio para clonar el producto amplificado en un vector de expresión.

El vector utilizado en este protocolo es PG wc FOS GFPA gateway. Vector de destino. Después de la creación del vector, indicado para transponer.

La enzima necesaria para la transposición se transcribe primero in vitro utilizando el kit M message M machine de Ambion y el plásmido PGB 600 antes de las inyecciones experimentales. Pruebe la eficacia de cada lote de transposas inyectando junto con un potenciador conocido, como el mouse socks. 10 potenciador.

Para prepararse para las inyecciones, estire las agujas utilizadas para microinyección a partir de vidrio capilar de filamento con diámetro externo de 1,2 milímetros en un estirador de micropipetas Sutter P-97. Utilice un programa que produzca una punta resistente con una conicidad aguda para penetrar los coriones intactos con una hoja de afeitar limpia y una regla micrométrica. Rompa las puntas manualmente bajo un microscopio estereoscópico hasta un diámetro externo de aproximadamente 15 micrómetros.

Las agujas pueden almacenarse durante un día en un recipiente cubierto. Mantenga la población de peces cebra en un ciclo regular de luz-oscuridad con 14 horas de luz bajo condiciones estándar el día anterior a realizar las microinyecciones. Prepare los peces para apareamientos programados en pequeños tanques de cría.

Coloque tres hembras o dos machos por tanque en filas paralelas en la mañana de las microinyecciones, poco después de que comience el ciclo de luz. Combine machos y hembras en agua tratada del sistema limpio para la producción de huevos. Revise los peces con frecuencia y recoja los huevos dentro de los pocos minutos posteriores a su producción para obtener lotes bien sincronizados.

Mantenga la producción de huevos durante dos a tres horas combinando continuamente grupos frescos de peces durante la mañana con una pipeta de vidrio de cinco y un cuarto de pulgada de diámetro interno, equipada con una perilla de látex. Ordene los embriones recolectados en placas de Petri de 60 por 15 milímetros, parcialmente llenas con medio para embriones, en grupos de 50 embriones. Marque la hora de recolección en la tapa de cada placa.

Para cada postura de embriones recolectada, guarde un plato con 50 embriones como control no inyectado entre las recolecciones de huevos. Prepare soluciones de inyección frescas mezclando los siguientes ingredientes en un tubo microcéntrifugo y almacénelas sobre hielo. Coloque las agujas de inyección en platos portadores y llénelas con 1,5 a dos microlitros de solución de inyección.

Mediante la pipetación de gotas de 500 nanolitros sobre el extremo ancho de cada aguja. El líquido será arrastrado hacia la punta por acción capilar. Prepare al menos dos agujas para cada solución de inyección.

Cargue la aguja llena en el portador manual de agujas de una bomba pico neumática o un inyector de presión similar. Configure y conecte al tanque de nitrógeno según las instrucciones del fabricante. Calibre los volúmenes de inyección midiendo el diámetro de las gotas expulsadas en aceite mineral sobre un portaobjetos micrométrico, normalmente con un tiempo de inyección de 120 milisegundos.

Con una presión de 20 PS, obtendré una gota de aproximadamente un nanolitro utilizando un microscopio estereoscópico con un aumento de seis a 10 veces. Sujete el embrión en su lugar con un par de pinzas finas y empuje la aguja de inyección con presión constante a través del corion hasta el vitelo de un embrión en la etapa de una célula o de dos células temprana, coloque la punta de la aguja en el vitelo justo debajo de los blastómeros, expulse aproximadamente un nanolitro de solución de inyección y retire la aguja. Para cada construcción, inyecto más de 200 embriones o un número igual a este. Seleccione los embriones eliminando los huevos no fertilizados, los embriones dañados, las inyecciones fallidas o los embriones sin rojo de fenol en los blastómeros.

A continuación, incubamos los embriones y el medio embrionario a 28,5 grados Celsius hasta el momento adecuado para las observaciones. Ahora mostraremos algunos resultados representativos de elementos potenciadores que producen patrones específicos de tejido en la expresión de GFP en el embrión de pez cebra. Estudiamos genes expresados en hueso o cartílago durante.

Aquí hay un ejemplo de un elemento potenciador ubicado aguas arriba del gen acan que regula la expresión en el cartílago facial craneal a los tres días post fertilización. Aquí hay otro potenciador, esta vez del gen bumper, que regula la expresión en células óseas. A los cinco días, entre los muchos potenciadores que hemos identificado, encontramos poca correlación entre la ubicación relativa respecto al gen y la regulación de la expresión.

Al elegir las secuencias para probar, es importante recordar que un potenciador puede ubicarse a cientos de kilobases hacia arriba o hacia abajo respecto a un gen o dentro de uno de los intrones, como se observa en este embrión. Una porción considerable de secuencias no parece regular la expresión específica de tejido. Estas a menudo muestran muy poca fluorescencia o pueden presentar algunas células dispersas en dos sitios comunes de expresión ectópica: el epitelio y el músculo esquelético.

Acabamos de mostrarle cómo identificar elementos potenciadores mediante la conservación de secuencias y probar su función mediante transgénesis Mosaic en pez cebra. Al realizar este procedimiento, es importante examinar cuidadosamente la calidad del ADN y ARN destinados a las inyecciones. Asimismo, asegúrese de analizar minuciosamente todos los embriones inyectados, especialmente si solo espera expresión en un pequeño grupo de células.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.