Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte I: La lignina

La determinación del contenido y la composición de lignina en las paredes celulares de las plantas comienza con material vegetal seco, que se somete a diversas extracciones. El material resultante consiste únicamente en paredes celulares, el cual luego se divide para determinar el contenido de lignina. El material de las paredes se somete a hidrólisis con bromuro de acetilo y los monómeros solubilizados se cuantifican mediante espectrometría UV para determinar la composición de la lignina.

El material de la pared se hidroliza mediante citólisis. Los componentes de lignina solubilizados se derivan luego a sus derivados volátiles de trimetilsilano, que pueden separarse y cuantificarse mediante cromatografía de gases en conjunto con espectrometría de masas. La determinación de la composición de polisacáridos de la matriz y el contenido de celulosa se muestra en otro video titulado Análisis Composicional Integral de las Paredes Celulares de Plantas, parte Dos Carbohidratos.

Hola, soy Marcus Pauley, director de las instalaciones analíticas Wall en el Centro de Investigación de Bioenergía de los Grandes Lagos ubicado en la Universidad Estatal de Michigan. Soy Cliff Foster, gerente de la instalación analítica de la pared celular. Les mostraremos el procedimiento para determinar el contenido y la composición de muestras de biomasa vegetal.

Las plantas convierten la energía luminosa del sol en energía química, como la biomasa. La biomasa vegetal consiste principalmente en paredes celulares, una red compleja de diversos polímeros que rodean todas las células vegetales. Aquí determinamos la composición de los materiales de la pared celular vegetal para evaluar el potencial de transformar estos lignocelulósicos X, que son un recurso renovable altamente abundante, en biocombustibles.

Hoy nos centraremos en el polifenol lignina en otro video titulado Análisis composicional completo de las paredes celulares vegetales, parte dos carbohidratos. Nos enfocaremos en el análisis de polisacáridos. Para comenzar este procedimiento, agregue tres bolas de acero inoxidable de 5,5 milímetros a un tubo de rosca de 2 mililitros y aproximadamente de 60 a 70 miligramos de material vegetal seco al aire o liofilizado.

El material puede ser molido hasta obtener un polvo fino utilizando el eyewall, un robot de molienda y dispensación. El eyewall toma el tubo y lo agita durante 30 segundos, donde, gracias a las bolas de metal, el material se muele hasta convertirse en un polvo fino; luego, el polvo vegetal molido pero compacto se afloja mediante un procedimiento alternativo no robótico de bajo rendimiento. En la segunda parte se presenta un procedimiento retro, agregue 1,5 M de etanol acuoso al 70 % al material molido, vortexee completamente y centrifugue a temperatura ambiente.

Este tratamiento solubiliza la mayoría de las proteínas y orgánulos celulares; aspire el sobrenadante y añada un volumen igual a volumen. Solución de cloroformo-metanol al pellet insoluble en alcohol, agite completamente para resuspender el pellet y centrifugue. El cloroformo-metanol extrae los compuestos hidrofóbicos, como los lípidos; tras la centrifugación, aspire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 500 microlitros de acetona.

Para secar la muestra, evapore el disolvente con un chorro de aire a 35 grados Celsius hasta que esté seca; las muestras secas pueden almacenarse a temperatura ambiente hasta su posterior procesamiento. Para iniciar la eliminación del almidón de la muestra reus, suspenda el precipitado en 1,5 mL de acetato de sodio 0,1 molar pH 5, tape los tubos y caliéntelos en un bloque térmico para gelatinizar el almidón. Después de enfriar la suspensión en hielo, agregue la mezcla de enzimas degradadoras de almidón, tape el tubo y vortexee completamente; incube la suspensión durante la noche.

En el agitador a 37 grados Celsius, un agitador rotatorio garantiza una mezcla adecuada. Después de la incubación nocturna, detenga la digestión calentando en un bloque térmico a 100 grados Celsius durante 10 minutos. Luego, centrifugue y deseche el sobrenadante, que contiene almidón solubilizado.

Lave el pellet restante tres veces usando 1,5 mL de agua cada vez, agitando en vórtex, centrifugando y decantando como se demostró anteriormente. Finalmente, re suspenda el pellet en 500 microlitros de acetona y evapore el disolvente con un flujo de aire a 35 grados Celsius hasta sequedad. Las muestras secas que contienen pared celular aislada o pata, sin celulosas, están listas para análisis posteriores y pueden almacenarse a temperatura ambiente.

Comience pesando de uno a 1,5 miligramos de material de pared celular preparado. El material puede pesarse manualmente o de forma automatizada con la pared ocular, como se demostró en la segunda parte. Enjuague las paredes del tubo con 250 microlitros de acetona para recoger el material de la pared celular en el fondo del tubo y evapore suavemente la acetona bajo una corriente de aire.

Después de que la acetona haya evaporado, agregue suavemente 100 microlitros de aceto bromhídrico al 25% en volumen/volumen recién preparado en ácido acético glacial a lo largo de las dos paredes. Para evitar salpicaduras, el bromuro sutil descompone el polímero de lignina en sus monómeros acetilados. Luego tape el matraz aforado y caliente a 50 grados Celsius durante dos horas.

Caliente durante una hora adicional con cuatro textos cada 15 minutos y, finalmente, enfríe en hielo. A temperatura ambiente, después de enfriar el matraz, agregue 400 microlitros de hidróxido de sodio dos molar y 70 microlitros de clorhidrato de hidroxilamina 0,5 molar recién preparado; vortexee los matraces aforados. A continuación, neutralice la solución completando exactamente hasta la marca de dos mililitros en el matraz aforado con ácido acético glacial, tape y invierta varias veces para mezclar. Pipetee 200 microlitros de la solución que contiene los monoaldehídos hidrolizados y solubilizados en una placa ultravioleta específica de 96 pocillos y lea la placa en un lector de placas a 280 nanómetros. Lea la placa al menos tres veces y promedie la absorbancia, ya que las partículas pueden causar una ligera variación en los valores de absorbancia.

Determine el porcentaje de lignina soluble en bromuro sutil o una BSL utilizando el coeficiente de planta apropiado con la fórmula presentada en el protocolo escrito. La lignina es una red de polifenoles que consiste principalmente en tres subunidades: P-hidroxifenil, guaíacil y unidades de siringil, debido a la determinación de la composición de lignina en el material vegetal. Comience transfiriendo aproximadamente dos miligramos de material de pared celular a un tubo de vidrio con tapón roscado para citólisis.

A continuación, prepárese para preparar la solución al 2,5 % de fluoruro de boro y etilato, y al 10 % de etanotiol en dioxano. Dado que el dioxano es muy peligroso, no retire ninguna muestra ni equipo de la campana. Recuerde trabajar con mucha precaución y usar un globo lleno de gas nitrógeno para reemplazar el volumen perdido en la botella de dioxano con nitrógeno.

Prepare la solución mezclando los siguientes volúmenes por muestra: 175 microlitros de dioxano, 20 microlitros de ETSH y cinco microlitros de BF tres. Después de mezclar, añada 200 microlitros de la solución a cada muestra. Purifique el espacio de cabeza del vial con gas nitrógeno y tápelo.

Inmediatamente, proceda a calentar las muestras a 100 grados Celsius durante cuatro horas con mezcla suave cada hora. Finalice la reacción de lisis colocando la muestra en hielo durante cinco minutos. Luego, agregue 150 microlitros de bicarbonato de sodio 0,4 molar para neutralizar y vortexee.

Para la limpieza de los productos de degradación de la lignina, agregue un mililitro de agua y 0,5 mililitros de acetato, vortexee y deje que las fases se separen. La capa de acetato de etilo estará en la parte superior y el agua en la parte inferior. Transfiera 150 microlitros de la capa superior de acetato de etilo que contiene los componentes de la lignina a un tubo de dos mililitros, asegurándose de que no se transfiera agua.

Tras la transferencia desde la capa superior de acetato de etilo, evapore el disolvente utilizando un concentrador con aire. Añada 200 microlitros de acetona y evapore. Repita el tratamiento con acetona dos veces para eliminar el exceso de agua.

A continuación, derive los componentes de la lignina a sus derivados volátiles de trimetilsilano. Añada 500 microlitros de acetato de etilo, 20 microlitros de purina y 100 microlitros de NO-bis(trimetilsilil)acetamida a cada tubo. Incube durante dos horas a 25 grados Celsius.

Al final de las dos horas, transfiera 100 microlitros de la reacción a un vial de GC-MS y agregue 100 microlitros de acetona. Analice las muestras mediante GC equipado con un espectrómetro de masas cuádruple o un detector de ionización de llama. Para obtener información sobre la columna y los detalles del análisis, consulte el protocolo escrito adjunto.

A continuación se presentan algunos resultados representativos del análisis de lignina utilizando madera de álamo como material vegetal. Según este análisis, el 22% del material de álamo consiste en la lignina polifenólica. La composición de los componentes de la lignina se analizó mediante GCMS.

Los picos se identifican mediante tiempos de retención relativos utilizando un patrón interno de tetra coano o mediante iconos de espectro de masas característicos de 299 m/z, 269 m/z y 239 m/z para los monómeros S y H, respectivamente. La composición de los componentes de la lignina se cuantifica ajustando el área total de los picos al 100 %. El análisis composicional muestra que esta muestra particular contiene principalmente unidades siringilo o S. Sin embargo, también son abundantes las unidades Goya, aol o guayacilo (G).

Obviamente, la cantidad y la composición de la unidad monolignólica pueden variar según el tejido vegetal y la especie. Acabamos de mostrarle cómo determinar el contenido y la composición de lignina en material vegetal para el análisis de polisacáridos. Pase a la segunda parte.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.