Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte II: Los hidratos de carbono

La determinación de la composición de polisacáridos de la matriz y del contenido de celulosa cristalina en las paredes celulares de las plantas comienza con material vegetal seco, que se somete a diversas extracciones. El material resultante consiste únicamente en paredes celulares, el cual luego se fracciona para determinar la composición de polisacáridos de la matriz. El material de las paredes se trata con un ácido débil para hidrolizar los polisacáridos no cristalinos, que principalmente son las hemicelulosas, convirtiéndolos en sus monosacáridos.

Los monosacáridos se derivan luego en sus correspondientes acetatos de aldol volátiles, que posteriormente se analizan y cuantifican mediante cromatografía de gases acoplada a un espectrómetro de masas para la determinación de celulosa cristalina. Las paredes celulares se tratan con el reactivo graph, una mezcla de ácidos que elimina los componentes de la pared no cristalinos. La celulosa cristalina restante se degrada hasta su monómero glucosa, que puede analizarse colorimétricamente.

Se demuestra la determinación del contenido y la composición de lignina en otra publicación de video de J titulada Análisis Composicional Integral de las Paredes Celulares de Plantas, parte Uno Lignina. Hola, soy Marcus Pauley, director de la instalación analítica de paredes celulares en el Centro de Investigación de Bioenergía de los Grandes Lagos aquí en la Universidad Estatal de Michigan. Soy Cliff Foster, gerente de la instalación analítica de paredes celulares.

Hoy les mostraremos cómo determinar la composición de los polisacáridos presentes en el material de la pared celular vegetal, que es celulosa en diversas homocelulosas. Aquí, en el Centro de Investigación de Bioenergía de los Grandes Lagos, desarrollamos tecnología para convertir estos azúcares en biocombustibles. Para identificar una materia prima vegetal óptima, primero necesitamos evaluar el tipo y la abundancia de azúcares presentes en esta biomasa.

En otro video titulado Análisis Composicional Integral de las Paredes Celulares de las Plantas, parte uno Lignina, nos centraremos en el análisis de polifenoles. Así que comencemos. Inicie este procedimiento aislando las paredes celulares.

Muela aproximadamente de 60 a 70 miligramos de material vegetal seco con bolas de acero inoxidable de 5,5 milímetros en un tubo de tapón roscado SAR TED de dos mil. Utilizando un molino REM como alternativa de alto rendimiento, emplea un robot de molienda y dispensación denominado eyewall según se describe en la primera parte. Una vez finalizada la molienda, retira las bolas de acero.

Continúe aislando las paredes celulares y eliminando el almidón residual como se muestra en la primera parte y se describe en el protocolo escrito adjunto. Pese dos miligramos de material de pared celular de almidón DS en un tubo de 2 ml. Una forma de alto rendimiento de realizar esta tarea es el robot eyewall.

El robot toma un tubo que contiene material vegetal molido y perfora un orificio en la parte inferior del tubo. Luego, el tubo perforado se coloca sobre un alimentador VI. Se coloca un tubo vacío sobre una balanza y se desplaza debajo del alimentador VI; mediante vibración, el material se filtra a través del orificio del tubo superior cargado hacia el tubo inferior vacío hasta que se acumula la cantidad deseada de material.

Añada 100 microgramos de acetol como estándar interno. Enjuague las paredes del tubo con acetona para recoger el material de la pared celular en el fondo del tubo y evapore la acetona muy suavemente bajo corriente de aire. A continuación, realice una hidrólisis con ácido débil.

Agregue cuidadosamente 250 microlitros de ácido tricloroacético dos molar o TFA a cada muestra, asegurándose de que ningún material salpique hacia las paredes del tubo. Tape herméticamente los tubos e incube a 121 grados Celsius en un bloque calefactor durante 90 minutos. Luego enfríe los bloques calefactores y las muestras en hielo y centrifugue los tubos a 10,000 RPM durante 10 minutos.

Transfiera 100 microlitros del sobrenadante ácido que contiene los azúcares solubilizados del polisacárido de la matriz a viales con tapón roscado, asegurándose de no perturbar el material del precipitado. El precipitado puede utilizarse para el ensayo de celulosa cristalina. Evapore el TFA en un tubo de vidrio bajo un flujo suave de aire en un dispositivo de evaporación.

Añada 300 microlitros de dos propanol para eliminar el ácido en exceso, agite en vórtex y evapore a 25 grados Celsius. Repita un total de tres veces. Con el fin de permitir la identificación de los monosacáridos mediante cromatografía de gases, realice una derivatización con acetato de aldol.

Primero, reduzca los monosacáridos a sus aldolas correspondientes de anillo abierto, que luego se acetilan. Consulte el protocolo escrito adjunto para obtener instrucciones detalladas. Cada paso del procedimiento sigue el protocolo mostrado previamente: adición del reactivo, incubación, evaporación bajo un flujo de aire, seguida por la eliminación del exceso de reactivo mediante varios pasos de lavado.

En los pasos finales, se extraen los acetatos aldólicos. Primero, agregue 500 microlitros de acetato de etilo y agite suavemente. Luego, añada dos mililitros de agua, tape los tubos y mezcle en vórtex. Centrifugue los tubos a 2000 RPM durante cinco minutos para obtener capas separadas claras, con acetato de etilo en la parte superior que contiene los acetatos aldólicos y agua en la parte inferior. Retire con pipeta 50 microlitros de la capa de acetato de etilo y colóquelos en viales para GC-MS con insertos. Diluya añadiendo 100 microlitros de acetona al vial de GC. El vial de GC puede almacenarse a cuatro grados Celsius.

Si el análisis por GCMS no se lleva a cabo inmediatamente, inyecte las muestras en un cromatógrafo de gases equipado con un espectrómetro de masas cuadrupolo. Para obtener información sobre la columna y los detalles del análisis, consulte el protocolo escrito adjunto. El material de partida para determinar el contenido de celulosa cristalina puede ser material aislado de la pared celular o material de la pared ya tratado con el ácido débil TFA, ya sea inmediatamente después del tratamiento ácido o en forma seca almacenada.

Después de eliminar el exceso de TFA con isopropanol como se mostró anteriormente, añadir al pellet de TFA en los dos M sars al tubo un M del reactivo up degra compuesto por ácido acético, ácido nítrico y agua, agregando una proporción de volumen a volumen de ocho a uno a dos. Tapar el tubo firmemente, vortexear y calentar en un bloque térmico a 100 grados Celsius durante 30 minutos. Como resultado de este tratamiento, solo queda celulosa cristalina en el pellet.

Todos los demás polisacáridos se hidrolizan enfriando las muestras en el bloque sobre hielo hasta temperatura ambiente o más frío. Luego, centrifugue las muestras a 10.000 RPM durante 15 minutos; tras la centrifugación, deseche el sobrenadante asegurándose de que el precipitado no se altere y de que no se retire material del mismo. Con este fin, deje aproximadamente 150 microlitros del sobrenadante en el tubo y lave el precipitado varias veces con agua.

A continuación, realice una hidrólisis con ácido sulfúrico concentrado para hidrolizar completamente el cristal y el pellet de celulosa en glucosa. Comience añadiendo 175 microlitros de ácido sulfúrico al 72 % al tubo sarta e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación inicial, vortexee la muestra e incube otros 15 minutos.

Luego, agregue 825 microlitros de agua y agite en vórtex y centrifugue las muestras a 10.000 RPM durante cinco minutos. Es posible que haya algo de material marrón y soluble, principalmente lignina, que permanece en el tubo, mientras que la glucosa se encuentra en el sobrenadante. El contenido de glucosa en el sobrenadante se determina mediante el ensayo colorimétrico con anthrona.

Este ensayo se realiza en una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos. Elabore una curva estándar de glucosa por duplicado siguiendo las instrucciones del protocolo escrito adjunto. Prepare las muestras combinando 10 microlitros de cada muestra, sobrenadante y 90 microlitros de agua en pocillos separados de la misma placa de microtitulación; finalice añadiendo 200 microlitros del reactivo recién preparado y descartado.

A continuación, caliente la placa durante 30 minutos a 80 grados Celsius en una estufa con un difusor de calor de aluminio. Observe que las muestras que contienen glucosa cambian de color amarillo a verde azulado cuando finaliza el calentamiento. Deje que la placa se enfríe a temperatura ambiente y agite bien.

Lea la absorbancia a 625 nanómetros utilizando un lector de placas microtituladoras. El contenido de glucosa, el bloque estructural de la celulosa, se calcula en función de la absorbancia comparada con la curva patrón establecida en la misma placa. A continuación se muestran algunos resultados representativos del análisis de polisacáridos de un trozo de madera de álamo.

Los picos del cromatograma de gases se identifican mediante perfiles de masas y/o tiempos de retención de patrones. Los monosacáridos se cuantifican basándose en curvas patrón. El análisis de azúcares de los polisacáridos de la matriz muestra una alta abundancia de xilosa que representa la hemicelulosa xam, aunque también están presentes otros azúcares.

Según el análisis, el 40 % del material de álamo consiste en cristal y celulosa. Tenga en cuenta que estos contenidos y composiciones pueden variar de una planta a otra o entre diferentes anatomías vegetales. Acabamos de mostrarle cómo determinar el contenido de polisacáridos y el análisis composicional de la biomasa lignocelulósica para el análisis del lignano polifenólico.

Entérese de la primera parte. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos.