La importancia de la concentración de la proteína correcta para la cinética y la determinación de afinidad en el análisis de la estructura-función

El objetivo general de este artículo en video es proporcionar respuestas a las siguientes dos preguntas. Primera, ¿pueden hacerse estudios de interacciones proteicas de manera más confiable al medir la fracción de una muestra proteica que realmente es capaz de unirse a otra proteína? Segunda, ¿cómo puede el análisis cinético ofrecernos una mejor comprensión de las relaciones entre estructura y función?

Estas dos preguntas se abordarán en un experimento que involucra el instrumento Corp X 100, el cual detecta interacciones proteicas en tiempo real sin utilizar marcadores. Este experimento examinará la interacción de la cistatina B bovina con la cisteína proteasa papaína; la estructura cristalina de ambas proteínas en complejo indica varios residuos implicados en la unión a la proteasa, con el fin de determinar cómo cada uno de los residuos que interactúan afecta la interacción entre la cistatina B y la papaína. Varias variantes de la cistatina B se producen mediante mutagénesis dirigida a sitios específicos.

En experimentos de este tipo, siempre existe la posibilidad de que las proteínas recombinantes no se plieguen correctamente, se agreguen o se deterioren, lo que lleva a resultados incorrectos e irreproducibles. VIACORE X 100 tiene la capacidad de determinar la fracción de proteína disponible para unión mediante análisis de concentración sin calibración, abreviado como CFCA. Este enfoque permite determinar la concentración de proteína con actividad de unión conservada incluso cuando no están disponibles estándares de calibración.

CFCA se utilizará aquí para determinar la concentración de las variantes de cistatina B. Estos datos luego se utilizarán como entrada en la determinación de la cinética de unión de las variantes de cistatina B a Pepin, lo cual también se evalúa utilizando BOR X 100. Hola, soy CLA gram de GE Healthcare en Suecia.

Hoy mi colega Eva Pool le mostrará cómo realizar un análisis de la relación estructura-función utilizando BOR X 100. Las proteínas recombinantes pueden presentar plegamiento inadecuado o perder actividad de unión con el tiempo, y este comportamiento no puede detectarse mediante métodos que dependen de la medición de la concentración total. Esto puede llevar, de hecho, a datos cinéticos incorrectos tras las mediciones de concentración mediante análisis de concentración sin calibración. B.A core X 100 se utiliza para analizar la cinética y la afinidad de la interacción de variantes de cistatina B con pepane.

Estos parámetros proporcionarán una visión del mecanismo de unión. Comenzamos con una breve explicación del diseño experimental, así que empecemos. La interacción entre la cistina, la proteasa, la papaína y el inhibidor cistatina B está dominada por contactos hidrofóbicos, como lo revela la estructura cristalina de las dos proteínas en complejo.

Desde el lado del inhibidor, las áreas de contacto son los extremos N y C terminales y dos bucles en horquilla. En este estudio se analizan cuatro mutantes, cada uno de los cuales contiene una mutación de cisteína a serina introducida con el fin de prevenir la dimerización de la cistatina B. Basándose en el contexto revelado en la estructura cristalina, la leucina 73 se mutó a glicina, la histidina 75 a glicina y la tirosina 97 se cambió a alanina. Las dos mutaciones a glicina se introdujeron para examinar la importancia de las cadenas laterales de la histidina 75 y la leucina 73 en la unión a la pepsina; el residuo de tirosina se mutó a alanina para investigar la interacción entre el extremo C terminal de la cistatina B y la pepsina.

Se analizan los tres mutantes dobles, así como el mutante simple de INE tres a Siria, para evaluar su interacción con una variante catalíticamente inactiva de la papaína S metil popina. Esta forma inactiva del Proteus posee un grupo metilo unido a CYS 25 en la hendidura activa. Por simplicidad, denominaremos esta variante propan a lo largo del protocolo.

CFCA se basa en la medición de la velocidad de unión en condiciones en las que la velocidad está limitada por la difusión de las moléculas del analito hacia la superficie. Esto se favorece mediante altos niveles de inmovilización del ligando. Antes de comenzar el procedimiento de inmovilización, coloque el tampón HEPs utilizado en los experimentos en la bandeja izquierda e inserte ambos tubos.

También coloque una botella de desecho vacía en la bandeja derecha. Luego, inserte un nuevo sensor de yeso cinco en el instrumento, inicialícelo mediante el software Core X 100 y, en la pantalla de inicio, haga clic en la opción de herramienta del chip de acoplamiento. Haga clic en iniciar acoplamiento en el software.

A continuación, utilice el asistente de inmovilización para configurar el PAPE y la inmovilización apuntando al acoplamiento de CM cinco desde la pantalla de inicio; haga clic en el botón de otras opciones y luego seleccione asistentes. Esto muestra una ventana con los asistentes disponibles. Seleccione inmovilización y luego haga clic en el botón nuevo. En la parte inferior derecha, aparece la primera pantalla del asistente de inmovilización, donde el acoplamiento al sensor de yeso cinco es el predeterminado.

Marque la casilla debajo de la celda de flujo dos para inmovilizar en la celda de flujo dos. La celda de flujo uno se deja sin modificar para utilizarla como superficie de referencia entre las tres opciones disponibles a continuación. Marque la casilla especificar tiempo de contacto; el nivel de destino de la derecha cambia a tiempo de contacto, especifique un tiempo de contacto de 900 segundos.

A continuación, ingrese los parámetros de inmovilización bajo la solución de molécula de captura o ligando. Ingrese papaína. Luego haga clic en siguiente.

La siguiente pantalla muestra la disposición del rack de muestras. La posición uno contendrá etanolamina utilizada para desactivar los grupos activos restantes tras el acoplamiento dirigido del ligando papaína a la superficie del chip. Inserte la solución de etanolamina en la posición uno en la posición dos.

Coloque el ligando papaína, que se almacena en exceso de sulfato de metilo, y dilúyalo a 50 microgramos por mililitro en tampón de acetato de sodio 10 milimolar, pH 4,5. Reconstruya los reactantes de acoplamiento EDC y NHS del kit de acoplamiento de aminas con agua doblemente destilada; pipetee 85 microlitros de EDC en un vial. Tápelo y colóquelo en la posición tres.

Utilice el mismo volumen de NHS en la posición cuatro. Tenga en cuenta que el archivo cinco debe estar tapado y vacío para que el instrumento mezcle ED, C y NHS en este archivo. También recuerde llenar el archivo de lavado en la posición H2O con agua desionizada fresca.

Cuando el bastidor esté lleno según el esquema que aparece en la pantalla, haga clic en cargar muestras y coloque el bastidor en el instrumento. Una vez cargado el bastidor, haga clic en siguiente. Antes de iniciar la corrida, se muestra una lista de verificación.

Asegúrese de que se cumplan todos los puntos de la lista cuando corresponda. La corrida se inicia presionando el botón de inicio. La corrida se inicia durante el procedimiento de inmovilización.

Los datos se recopilan en tiempo real. Primero, se inyectan los reactivo de acoplamiento. A continuación, el papel se acopla a la superficie del chip y el procedimiento finaliza con la desactivación de los ésteres activos restantes.

Después de la corrida, una ventana de diálogo resume el resultado del proceso. En esta ventana se muestra el nivel de inmovilización. Todo el procedimiento de acoplamiento debe dar como resultado aproximadamente 3000 RU de papaína inmovilizada.

Una vez que la papaína se haya inmovilizado en el chip sensor, comience el análisis de CFCA diluyendo las muestras del mutante de cistatina B hasta una concentración total de aproximadamente 10 nanomolares en al menos 300 microlitros. Registre el factor de dilución, ya que lo utilizaremos más adelante en el ajuste del ensayo. Comience abriendo el cuadro de diálogo del asistente, tal como se describió en la sección anterior en la sección de concentración de la carpeta del ensayo.

Seleccione calibración libre, luego seleccione nuevo. La primera pantalla del asistente muestra la secuencia de inyección. Los ajustes pueden permanecer sin cambios, ya que aquí se utiliza un chip sensorial CM5 y un enfoque de ensayo de inmovilización directa.

Haga clic en siguiente en la pantalla siguiente. Deje las casillas de verificación de prime antes de ejecutar y ciclos de arranque marcadas. Además, mantenga el número predeterminado de ciclos de arranque sin cambios en tres.

Introduzca el tampón heaps en el campo de nombre de la solución. Luego haga clic en siguiente. En la pantalla siguiente, introduzca el nombre de la solución de regeneración, que es hidróxido de sodio 20 milimolar.

Deje los demás parámetros sin cambios. Haga clic en siguiente para ver la tabla de muestras. Configure las muestras de acuerdo con la tabla de muestras.

Cada fila en la tabla de muestras da como resultado dos ciclos: uno con un caudal de 10 microlitros por minuto y otro con 100 microlitros por minuto. Inicie la corrida con un blanco.

Luego ingrese el nombre, el factor de dilución, el coeficiente de difusión a 20 grados Celsius y el peso molecular. Para cada mutante, el coeficiente de difusión se puede calcular utilizando la herramienta web en el sitio web del producto. Un enlace a esta herramienta se proporciona en el navegador de soporte del software.

Dado que se recomienda ejecutar cada muestra por duplicado, copie toda la tabla desde la fila en blanco hasta la última muestra y péguela en la parte inferior de la tabla. Haga clic en siguiente para continuar. La siguiente pantalla muestra el portamuestras.

Coloque las muestras y los reactivos en el soporte según la distribución indicada por el software. Cargue el soporte en el instrumento presionando el botón cargar muestras. Luego haga clic en siguiente.

Después de cargar las muestras, se muestra una pantalla de recordatorio con una lista de verificación. Asegúrese de revisar todos los puntos y luego presione inicio. Los datos se recopilan en tiempo real durante la ejecución.

Cuando finalice la corrida, cierre la ventana que muestra los datos recopilados. Observe que ha aparecido un nuevo elemento de resultado en la ventana principal. Para calcular las concentraciones a partir de los datos, seleccione el nuevo elemento de resultado y haga clic en el botón.

Evalúe mediante núcleo X 100. Inicie el software de evaluación que muestra todos los datos recopilados desde la barra de herramientas, seleccione análisis de concentración y luego calibración libre del menú. En la primera ventana, elija los datos a incluir en el análisis.

Desplácese por la lista y avance por la lista de vistas para ver los datos de todas las muestras. Si desea excluir algún dato, elimine la marca de verificación de la lista. Haga clic en siguiente para iniciar el cálculo.

El modelo de interacción CFCA se ajusta automáticamente a los datos experimentales; cuando finaliza el ajuste, los resultados se muestran para cada muestra en la ventana de resultados. Recorra los ajustes de cada muestra seleccionando la fila correspondiente en la tabla. La columna denominada concentración medida muestra la concentración en la muestra que fue analizada.

La concentración en la muestra original se calcula utilizando el factor de dilución introducido anteriormente y se muestra en la columna de concentración calculada; al terminar, haga clic en finalizar para guardar el resultado. Ahora que conocemos las concentraciones de las proteínas obtenidas mediante el análisis de CFCA, contamos con una excelente base para nuestras mediciones cinéticas posteriores. El análisis cinético nos ayudará ahora a comprender la importancia de los residuos clave de aminoácidos en el mecanismo de unión.

Comencemos con la configuración del análisis cinético. El análisis cinético comienza acoplando un nuevo chip sensor CM5 al instrumento desde la pantalla de inicio. Elija crear un flujo de trabajo de ensayo para la afinidad cinética.

En la esquina superior izquierda, aparece una ventana de diálogo donde se introduce la información sobre el ligando. Escriba el nombre papaina en el campo de nombre del ligando y seleccione otra proteína de la lista de tipos de especies. A continuación, seleccione inmovilizar el ligando covalentemente utilizando el chip sensorial CM cinco entre los dos métodos alternativos de unión del ligando presentados; ahora se muestra el protocolo recomendado del ensayo en el lado derecho de la ventana.

Comienza con un paso de inmovilización seguido por un paso de ensayo. Presione continuar para proceder. Guarde el flujo de trabajo del ensayo según se solicite ingresando un nombre y presionando guardar.

El software ahora describe el flujo del ensayo con botones asociados a cada paso. El primer paso dentro de la preparación de la superficie del sensor es encontrar un pH de movilización. Dado que este pH es conocido, presione ingresar valor conocido en el cuadro de diálogo que aparece.

Introduzca el nombre del tampón acetato y pH 4,5 y elija guardar. El flujo del ensayo ahora se actualiza con una marca de verificación verde para indicar que este paso se ha completado. Ahora es el momento de inmovilizar, presione el botón de ejecución en el paso de inmovilización.

Esto abre el mismo asistente que se utilizó para el propano y la inmovilización en el análisis CFCA. La inmovilización de la papaína para el análisis cinético se configura de la misma manera aquí, excepto que se inyecta una solución más diluida durante un tiempo menor. Esto se hace con el fin de inmovilizar menos papaína y así evitar situaciones en las que las tasas de unión de las cistatinas y sus mutantes estén limitadas por difusión, permitiendo medir los datos cinéticos de forma aislada. Dado que el nombre del ligando y el pH de inmovilización se introdujeron en pasos anteriores del flujo del ensayo, ambos valores ya están preestablecidos en esta etapa.

La única actualización necesaria es de 50 segundos para el tiempo de contacto. La inmovilización luego continúa como se mostró anteriormente. El nivel de unión esperado tras la inmovilización es de 50 R ru.

Una marca de verificación verde junto al botón de ejecución indica que la inmovilización está completa. A continuación, introduzca la solución de regeneración en el flujo de trabajo en el paso. Encuentre las condiciones de regeneración haciendo clic en introducir valores conocidos en el cuadro de diálogo que aparece.

Introduzca la solución de regeneración y el tiempo de contacto. Luego haga clic en guardar. Ahora que el ligando está inmovilizado y se han introducido las condiciones de regeneración, todo está listo para generar datos cinéticos en el cuadro de ensayo de afinidad cinética; presione el botón de ejecución para iniciar el primer paso de la cinética.

El asistente de afinidad describe la secuencia de inyección de cada ciclo para la cinética de ciclo único, que se utiliza aquí; no es necesario cambiar nada. Haga clic en siguiente para continuar. En el siguiente paso, mantenga la configuración predeterminada que indica el cebado del sistema antes de la ejecución.

Elige ejecutar un ciclo de arranque para equilibrar la superficie del chip. A continuación, define los parámetros de inyección para la muestra. Dado que la solución de regeneración se especificó previamente y la configuración está predefinida, no es necesario cambiar ninguno de los parámetros en la pantalla.

Haga clic en siguiente. Finalmente, especifique las muestras. Ingrese dos filas para cada variante mutante, una en blanco y la otra con muestra.

Un ciclo en blanco se indica configurando el parámetro de concentración más alta en cero. Dos. Las variantes de cistatina B pueden ajustarse en cada corrida. Para cada mutante, ingrese el peso molecular, la concentración más alta y el factor de dilución, luego presione siguiente.

En la siguiente pantalla, se muestra el esquema del soporte para muestras. Prepare una serie de diluciones de las muestras de proteína y coloque los viales con tapas en el soporte. Según se indica en la pantalla, coloque un vial con tampón en la posición 13 y un vial con la solución de regeneración en la posición 14. Asegúrese de llenar la posición de agua con agua fresca.

Coloque el soporte en la máquina y cargue las muestras presionando el botón de carga de muestras y haga clic en siguiente. Como antes, realice una verificación final antes de continuar con la ejecución del experimento presionando inicio; los datos de interacción aparecen en tiempo real. Cuando finalice la corrida, proceda inmediatamente con la ejecución de las variantes restantes de cistatina B según lo acaba de demostrar.

Si se realizan sucesivamente las variantes restantes de la cistatina B, omita el paso de cebado y el ciclo de arranque desmarcando las casillas correspondientes en el paso. Cuando cada corrida haya finalizado, los datos se pueden acceder desde el enlace. Todos los resultados en el flujo de trabajo del ensayo.

Aparece una ventana de diálogo con todos los resultados generados dentro de este flujo de trabajo. Para calcular las constantes de velocidad cinética, seleccione el resultado a evaluar y presione evaluar; un software de evaluación principal X 100 se inicia nuevamente mostrando todos los datos colectivos. Seleccione cinética de afinidad en el menú de la barra de herramientas.

En la primera pantalla, se selecciona el mutante de cisteína tres a siriano para su evaluación. Los datos de este mutante se muestran junto con la corrida en blanco realizada para este mutante; continúe haciendo clic en Siguiente. La siguiente pantalla muestra los datos con la corrida en blanco restada de la corrida con la muestra.

Elige evaluar la cinética haciendo clic en el botón de cinética. Ahora selecciona ajustar los datos a un modelo de interacción uno a uno. Al hacer clic en el botón ajustar, el ajuste se muestra en la pantalla conforme se calcula.

Una vez que esté listo, se aplican automáticamente controles de calidad que se resaltan en la parte inferior. Revise los elementos de control de calidad y luego examine los datos del gramo sensor para asegurarse de que los gramos sensor muestren una curvatura suficiente. Además, observe la gráfica de residuos que muestra las diferencias entre los datos recopilados y el modelo ajustado.

Preste atención a las desviaciones sistemáticas y no aleatorias. Este ajuste es aceptable. Ahora observe los datos cinéticos en la pestaña de informe.

La constante de velocidad de asociación, la constante de velocidad de disociación y la constante de disociación en equilibrio. Una vez finalizado, presione finalizar y repita el mismo procedimiento para todos los demás mutantes. A continuación se muestran resultados representativos del análisis de CFCA para las diferentes variantes de cistatina B examinadas.

Los datos de concentración de unión específica se extraen de los sensogramas obtenidos a caudales de 10 y 100 microlitros por minuto. Al comparar la concentración determinada mediante una medición de dos ciclos de 80 con la determinada mediante CFCA, es evidente que, aunque en la mayoría de los casos la proteína está completamente activa para la variante leucina 73 glicina, la fracción de proteína activa es muy baja. La cinética de unión de las variantes de cistatina B a pepina se determina utilizando cinética de ciclo único.

Los gramos del sensor muestran datos de blanco y referencia restados, con la cinética de un modelo de interacción uno a uno superpuesto en negro. La concentración de unión específica medida por CFCA para la variante leucina 73 es solo aproximadamente el 10 % de la concentración total de proteína determinada mediante una medición de dos 80. Al utilizar la concentración correcta para calcular los parámetros cinéticos, queda claro que la velocidad de asociación de Lucien 73 es similar a la de las otras variantes.

Si bien las tasas de asociación de los mutantes son comparables a la del proteína de tipo silvestre, la constante de velocidad de disociación de los mutantes puede ser hasta casi dos órdenes de magnitud mayor, con un aumento correspondiente en la constante de disociación en el equilibrio. La reducción en las afinidades depende principalmente de tasas de disociación aumentadas, lo que indica que tanto el segundo bucle de unión como el extremo C-terminal de la cistatina B contribuyen a la afinidad de unión al mantener al inhibidor unido a la enzima una vez que se ha formado el complejo. El uso del análisis de concentración sin calibración fue esencial para esta conclusión, ya que resultó que uno de los mutantes tenía una actividad de unión muy baja. Mi colega Pol ahora les ha mostrado cómo utilizar el bi core X 100 en un estudio funcional estructurado. Al realizar estos experimentos, es importante recordar que, aunque tanto el análisis de concentración como el cinético se basan en el mismo procedimiento de unión, las condiciones experimentales son bastante diferentes.