El análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales

El objetivo general del siguiente experimento es caracterizar ensamblajes proteicos grandes mediante espectrometría de masas estructural. Esto se logra preparando capilares plateados con oro para la ionización por electroaspersión de flujo nano. Como segundo paso, se prepara la muestra y se calibra el espectrómetro de masas para mediciones de alta masa.

A continuación, se optimizan las condiciones experimentales con el fin de mantener los complejos proteicos intactos en la fase gaseosa. Luego se adquieren espectros de MS y espectros en tándem. Los espectros de MS mostraron estados de carga que correspondían en masa al complejo intacto, mientras que los experimentos de MS en tándem produjeron el patrón de asociación de monómeros y complejos desprovistos.

Hola, soy Naam Kiba del Laboratorio de Miron en el Instituto Whiteman de Ciencia, y yo soy Isaac Ky. También soy del laboratorio de Michelon. Hoy queremos mostrarles el procedimiento básico para analizar complejos proteicos grandes mediante espectrometría estructural, y utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para caracterizar complejos proteicos y definir su geometría estequiométrica, composición y redes de interacción. Comencemos.

El análisis de complejos de proteínas no corrientes se realiza mediante la técnica de inmunización por pulverización aérea utilizando capilares Emm Plus o Qua. Este capilar C puede estirarse hasta obtener una punta fina de aproximadamente un micrómetro de diámetro y luego recubrirse con un material conductor como oro. Estos capilares están disponibles comercialmente, como se puede ver aquí.

Sin embargo, es mucho más rentable su uso. Las capilares de vidrio, eh, que pueden enfriarse y recubrirse hasta alcanzar el estado listo para usar, se someten a enfriamiento en este dispositivo de agrupamiento de agujas y recubrimiento en este dispositivo de recubrimiento, eh. Para comenzar este procedimiento, fije dos tiras de una almohadilla adhesiva de doble cara en la parte inferior de una placa de Petri, manteniendo las tiras separadas por dos centímetros.

Coloque una varilla de vidrio en el centro de una de las almohadillas. La almohadilla adhesiva mantiene las capilares en su lugar y la varilla de vidrio sostiene las capilares preparadas y evita que se rompan las puntas de las capilares. Se utilizaron capilares de vidrio de silicato Boris con un diámetro externo de un milímetro y un diámetro interno de 0,78 milímetros.

Inserte un capilar en la aguja, sujételo suavemente en su lugar y ajuste su posición para que quede en el centro del filamento de calentamiento. Apriete las abrazaderas suavemente hasta que los capilares queden firmes en ambos extremos. Tire del capilar utilizando el programa predefinido que se muestra aquí.

Sin embargo, recuerde que el proceso de programación del extractor es un proceso de prueba y error. Hasta obtener una forma de punta aceptable, cada capilar extraído da lugar a dos capilares con forma final. Retire los capilares extraídos del instrumento e inspeccione las puntas, descartando aquellos que estén deformados o rotos.

Utilice pinzas de posicionamiento romas para colocar los capilares en la placa de Petri. La base de los capilares se adhiere a la almohadilla adhesiva y la parte superior se apoya en la varilla de vidrio con la punta orientada hacia arriba. Continúe tirando de los capilares hasta que la placa de Petri esté llena.

Aproximadamente 80 capilares caben en un plato de 10 centímetros de diámetro. A continuación, recubra los capilares con oro. Inserte la placa en el evaporador de oro por pulverización catódica.

Asegúrese de que el suministro de gas se elija según las instrucciones del fabricante y active un ciclo de recubrimiento predefinido. El recubrimiento se repite de tres a seis veces hasta que los capilares adquieran un color dorado uniforme. Una vez que los capilares estén listos, proceda a calibrar el espectrómetro de masas.

La mayoría de los experimentos realizados con complejos MultiPro se llevan a cabo mediante un espectrómetro de masas cuadrupolo con tiempo de vuelo y electroaspersión como este. Entrada de waters, modificada para masas elevadas. Antes de cargar la muestra proteica, calibre el espectrómetro de masas utilizando yoduro de cesio.

Primero, prepare una solución de 100 miligramos por mililitro de cesio en agua purificada; el cesio se utiliza para la calibración de alta masa. Dado que los agregados de sal cargados sencillamente abarcan un amplio rango de masas, desde una relación masa/carga de 393 hasta valores superiores a 10.000, utilice pinzas romas para tomar un capilar recubierto de la placa de Petri y cargue dos microlitros de la solución de cesio en el capilar.

Utilizando una punta cargada con gel einor. Deslice la solución hacia la punta del capilar, ya sea manualmente o mediante un adaptador de centrifugación. Introduzca el capilar en el porta-capilares y ajústelo de manera que la punta quede aproximadamente a 10 milímetros del borde del soporte.

Coloque la capilaridad bajo un microscopio óptico y utilice pinzas finas de tipo AA para recortar la punta. Es importante verificar que no haya burbujas de aire dentro de la capilaridad que puedan obstruir el flujo y que la capilaridad no esté obstruida. Además, asegúrese de que el recubrimiento de oro no se haya desprendido de la capilaridad.

En caso afirmativo, reemplace el capilar o recorte la punta y retire la sección sin recubrir. A continuación, conecte el porta-capilares al interfaz ESI de flujo nano. Gire el escenario XY, Z hacia atrás para evitar dañar el capilar y empuje el escenario hacia su posición activada.

El capilar debe colocarse a una distancia de uno a diez milímetros del orificio del cono. Aplique voltaje al capilar y presión baja de flujo nano hasta que comience la pulverización. Luego, intente reducir la presión de flujo nano a un valor mínimo.

Optimice la intensidad de la señal ajustando la posición del escenario XYZ, el voltaje del capilar, la presión de flujo nano y el flujo de gas de desolvatación. Para detectar una amplia gama de masas de series de picos estacionales, deben optimizarse los voltajes de aceleración. Los parámetros utilizados aquí son: capilar de 1,3 a 1,7 kilovoltios, cono de muestra de 80 a 150 voltios y cono de extracción de uno a tres voltios, para optimizar la transmisión de iones de alta masa, que requieren condiciones suaves de desalación.

La presión de respaldo se eleva a entre cinco y seis milibares en la etapa de vacío inicial entre la fuente y el analizador. Para aumentar la presión de respaldo, reduzca cuidadosamente la conductancia de la línea de vacío de la fuente hacia la bomba espiral cerrando parcialmente la válvula de aislamiento, mientras monitorea el efecto sobre la intensidad de la señal. Al configurar completamente los espectrómetros de masas, recolecte aproximadamente 30 escaneos a un escaneo por segundo en un rango de relación carga-masa maestro entre 1000 y 15 000; después de la adquisición, calibre el tiempo de vuelo utilizando la tabla de calibración adecuada.

Ahora que la calibración está completa, se puede cargar la muestra de proteína. La muestra se prepara antes de calibrar el espectrómetro de masas; se requieren concentraciones bajas en micromolar. Si es necesario, concentre la muestra utilizando dispositivos de ultrafiltración centrífuga.

Verifique que el complejo proteico no esté absorbido en la membrana del dispositivo antes de su uso. Al comprobar el volumen y la absorbancia UV, solo pueden usarse soluciones volátiles para NESI, lo que a menudo hace necesario el intercambio de tampón. Puede utilizarse una columna de filtración en gel de microcentrífuga para eliminar todos los rastros de sales, moléculas de tampón o cualquier otro aducto no volátil.

En cambio, suspenda la muestra en una solución acuosa de acetato de amonio. Este paso crítico determina la calidad de los espectros.

Repita el intercambio de tampón hasta tres veces con una dilución mínima, inferior a un factor de 1,3 por dispositivo, hasta alcanzar el intercambio máximo. Si se requieren tanto la concentración como el intercambio de tampón, estos pueden realizarse simultáneamente mediante filtración ultra centrífuga, como se acaba de mostrar al principio de esta sección. A continuación, cargue la muestra como se muestra para la calibración con yoduro de cesio e inicie el aerosol.

Comience con la optimización inicial del aerosol hasta que se detecte la señal. Utilice la ecuación para el estado de carga promedio mostrada, en la que M es la masa del complejo. Sin embargo, en Daltons, la posición exacta de los estados de carga depende de la proteína.

Para evitar la disociación del complejo, no caliente la fuente de hierro. Apague el calentador o mantenga la temperatura por debajo de 40 grados Celsius. Varíe la posición del capilar, así como los voltajes del cono de muestra y del extractor.

Para maximizar la transmisión de hierro, un punto de partida posible es el voltaje del cono, 100 voltios para el cono extractor, un voltio y un voltaje de capilar de 1,5 kilovoltios. Verifique el cambio resultante en los espectros. Optimice estos parámetros en combinación con una presión de flujo nano para mejorar la desolvatación y eliminar los componentes residuales de agua y tampón.

Aumente el voltaje de polarización junto con la presión del gas en la celda de colisión. Los voltajes de polarización típicos se encuentran en el rango de 10 a 100 voltios con un flujo de gas de trampa de uno a 10 mililitros por minuto. Realice este procedimiento con cuidado para evitar la asociación del complejo, y ajuste las energías de colisión de trampa y transferencia.

A menudo se requieren voltajes más altos, generalmente dentro del rango de 10 a 30 voltios, para la transmisión de iones de alta masa. En este punto, es importante evitar la disociación inducida por colisión del complejo, como se muestra aquí. Una vez que se alcanza una señal estable, se recomienda reducir la presión del flujo nano y el voltaje del capilar a valores mínimos manteniendo al mismo tiempo un spray estable.

Después de recopilar varios escaneos, proceda a identificar los componentes del complejo mediante espectrometría de masas en tándem. Una vez que se haya obtenido una señal óptima y estable para el complejo proteico, seleccione un ion precursor y establezca el centro de masa en el ancho de aislamiento. Generalmente, utilice una resolución de masa baja de 12 y una resolución de masa alta entre 13 y 15 con un rango de masa amplio para detectar los productos de disociación de alta masa y baja carga, y luego reduzca el rango a los valores deseados para realizar la ms.

La disociación por MS del precursor de hierro se logra aumentando la energía de colisión, abreviada como CE, y la presión en la celda de colisión; aumente gradualmente la CE de captura o transferencia en pasos de 10 a 20 voltios y eleve la presión del gas de colisión de cero a cinco mililitros por minuto. Monitoree los cambios en los espectros hasta alcanzar las condiciones óptimas de activación. Una energía de activación elevada puede inducir la disociación de una o más subunidades del complejo intacto y aclarar las afinidades de interacción de las diferentes subunidades.

Seleccione más de una carga para el análisis de MS. En el caso de componentes solapados, adquirir un conjunto de espectros de MS en tándem ayuda a resolver la serie de cargas de las diferentes poblaciones. Además, los estados de carga más altos se disocian más fácilmente en comparación con los estados de carga más bajos; superponga el MS y el ms.

Espectros de MS para validar el aislamiento del ion precursor elegido. Además de la caracterización del complejo intacto mediante MS y MS/MS, generar subcomplejos más pequeños en solución bajo condiciones desnaturalizantes suaves y caracterizarlos también.

El análisis por MS y MS/MS de subcomplejos constituye la base para definir la arquitectura de subunidades del complejo. Para interrumpir parcialmente las interacciones entre subunidades, se añaden gradualmente disolventes orgánicos hasta una concentración del 50 %, o se modifica el pH de la solución mediante la adición de amoníaco o ácido fórmico hasta una concentración del 4 %. Finalmente, para determinar las masas de las subunidades individuales que componen el complejo, es fundamental adquirir el espectro bajo condiciones desnaturalizantes. Esto puede realizarse utilizando un tip Zip C4 con una proporción de agua-acetonitrilo del 25 al 75 % y ácido fórmico al 1 % como disolvente de elución. Todos los datos recopilados se procesan y analizan según se detalla en el protocolo escrito adjunto. Antes de cargar la muestra del complejo proteico, se calibra el espectrómetro de masas utilizando yoduro de cesio.

La serie de picos igualmente espaciados marcados en rojo se extiende sobre un amplio rango, desde una relación de carga principal de 393 hasta bien pasados los 10 000. Se asignan a agregados de sal con carga sencilla de la composición general del complejo de cesio más. Las señales adicionales entre los picos principales marcados en negro son causadas por especies con carga doble y triple de la serie del complejo de cesio dos más y del complejo de cesio tres más.

Incrementar la presión en la etapa inicial de vacío es esencial para detectar los cúmulos de alta masa. Aquí se demuestra el efecto de la presión sobre los picos de alta masa con lecturas de presión de 1,2 y 5,3 milibares. El espectro de masas para la presión más alta se muestra ampliado aquí.

Aquí se muestra un ejemplo de espectrometría de masas de un complejo de variante de lectina que da lugar a una distribución de estados de carga entre 3000 y 5.000 de relación masa/carga. Sin embargo, debido a una desalificación adecuada de los iones, los picos son amplios. Al aumentar el voltaje de polarización de cuatro a 15 voltios, lo que provoca un incremento en las condiciones de aceleración, se produce la eliminación de agua residual y componentes del tampón, obteniéndose un espectro altamente resuelto, cuya masa medida corresponde a un complejo pentamérico.

El estado de carga positivo 15 se seleccionó luego para el análisis de MS en tándem. El aumento en la energía de colisión provoca la liberación de un monómero altamente cargado centrado en una relación carga/masa de 1,664 y un complejo tetramérico despojado en el rango de 5,000 a 8,000 de relación masa/carga. El complejo de la variante de lectina también se examinó bajo condiciones desnaturalizantes, lo que llevó a la asociación del complejo.

De este modo, se puede determinar la masa exacta de las subunidades individuales que componen el complejo. Acaban de mostrarse cómo adquirir espectros de MS y espectros en tándem de iones de alta masa. Al realizar este procedimiento, es importante preparar adecuadamente la muestra y utilizar únicamente tampones volátiles compatibles con la espectrometría de masas.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.