Descifrar Caminos axonal de los grupos definidos genéticamente las neuronas en el tubo neural del polluelo Utilizando In ovo La electroporación
2 de mayo de 2010
Este video muestra la forma de visualizar las vías axonales de grupos genéticamente definidos de neuronas en la médula espinal de embriones de pollo que utilizan In ovo Electroporación de los genes reportero bajo el control de determinados elementos potenciadores.
Hola, soy Ham del laboratorio del Dr. Review Klar en el departamento de neurobiología médica de la Universidad Hebrea de Jerusalén. Hola, soy Sophie Esman y también soy del laboratorio de Lars. Hoy les mostraremos un procedimiento para Innovo, electroforesis y preparación de libro abierto de la médula espinal.
Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las trayectorias axónicas de poblaciones neuronales genéticamente definidas en la médula espinal embrionaria. Comencemos. Para iniciar este procedimiento, transfiera huevos de gallina leghorn blancos fertilizados desde temperatura ambiente a una incubadora humedecida, preferiblemente con bandejas oscilantes a 37-38 grados Celsius.
Es importante monitorear la temperatura y la humedad del incubador para obtener embriones viables y sincronizados. Los embriones de pollo se electrotransfieren cuando han alcanzado el estadio de Hamburger y Hamilton (HH) 18 a 20, que es una etapa óptima para la expresión específica dependiente de potenciadores. En esta etapa, la cabeza se encuentra en ángulo recto con respecto al tronco.
Asimismo, en la fase HH 18 a 20, también deben observarse una amplia red de vasos sanguíneos extraembrionarios, como los vasos de la línea vital anterior, posterior, derecha e izquierda. Los embriones de pollo alcanzan la fase HH 19 a 20 tras 66 horas de incubación, y en ese momento retire los huevos del incubador. Tras retirar los huevos, colóquelos horizontalmente y espere de cinco a diez minutos. Ahora el embrión se encuentra en el polo superior del huevo.
Antes de la electro poración, prepare la solución de Hank con 100 unidades por mililitro de penicilina y 0,1 miligramos por mililitro de estreptomicina. Prepare una mezcla deseada de ADN a dos o cinco microgramos por microlitro y agregue unos pocos cristales del colorante verde rápido para facilitar la visualización del ADN inyectado. Tenga listos un pipeta de boca, una aguja de jeringa estéril, tijeras pequeñas y una cinta.
Prepare microcapilares tirando de capilares de vidrio de 0,5 milímetros de diámetro con un extractor de pipetas. Coloque los electrodos de tungsteno en los micromanipuladores y conecte los electrodos al generador de pulsos. Ajuste el voltaje del generador de pulsos a menos 30 voltios, la duración de cada pulso a 50 milisegundos y el número de pulsos a tres.
Proceda a la electroporación antes de exponer y manipular los embriones. Inserte una jeringa en el polo estrecho del huevo y retire de cinco a seis mililitros de albúmina de cada huevo. La albúmina se retira para evitar que se derrame.
Al cortar en el siguiente paso, utilice las tijeras pequeñas para realizar el corte. Abra una ventana ovalada en la parte superior del huevo después de exponer el embrión de pollo, y humedézcalo con 0,5 a un mililitro de solución de Hanks y penicilina-estreptomicina. A continuación, use un pipeta de boca para cargar la micropipeta de vidrio.
Con una mezcla de colorante de ADN, una microcapilar de diámetro adecuado debe cargarse fácilmente con ADN. Bajo un estereoscopio, coloque el embrión para inyectar el ADN en el tubo neural. Posicione el embrión con la cola hacia usted.
En esta etapa del desarrollo, la médula espinal es claramente visible y, por lo tanto, no se requieren técnicas de contraste. La médula espinal está sellada tanto en el extremo cefálico como en el caudal. Sin embargo, al realizar punciones con microcapilares, es necesario hacer más orificios en el tubo neural y penetrarlo con un ángulo poco profundo; un microcapilar lo suficientemente delgado y con el diámetro adecuado debería penetrar el tubo sin dañarlo.
Inyecte el ADN utilizando un micropipeta de boca. Una microcapilar de diámetro adecuado debe liberar el ADN con una exhalación regular. El colorante verde debe extenderse desde la punta de la cola hasta las vesículas del cerebro en desarrollo.
Inyecte hasta que el tubo neural se llene con ADN. La electroporación es necesaria para que el ADN inyectado entre en las células primero. Coloque los electrodos en paralelo al tubo neural y lo más cerca posible de él sin tocar el tubo mismo. Asegúrese de que los electrodos estén cubiertos con líquido para permitir la conductividad eléctrica durante el pulso.
Por lo general, la solución de Hank añadida inmediatamente después de exponer el embrión es suficiente. Pero si no lo es, agregue una gota de solución de Hank justo antes del pulso, con los electrodos colocados y sumergidos en el líquido para realizar la electroestimulación; luego retire cuidadosamente los electrodos y selle la ventana y el huevo con cinta adhesiva. Es importante sellar completamente el huevo para evitar el secado del embrión durante el período de incubación posterior.
Coloque nuevamente el huevo en la incubadora e incube hasta que el embrión de pollo alcance el día embrionario de desarrollo seis o E seis, momento en el que es adecuado para la obtención de imágenes. Cuando el embrión electroporado haya alcanzado el día embrionario de desarrollo seis (E seis), tres días después de la electroporación, retírelo del huevo y colóquelo en una placa de Petri recubierta de silicona que contenga PBS utilizando tijeras finas.
Corte las membranas y extienda el embrión sobre su lado ventral utilizando alfileres insertados en la silicona para mantenerlo en su lugar. Utilizando una microcapilar de tungsteno afilada, realice una incisión longitudinal a lo largo de la placa del techo desde el cerebro posterior hasta la cola.
Realice dos incisiones longitudinales adicionales en ambos lados de la médula espinal, separando los ganglios de la raíz dorsal o GRD de la médula espinal. Separe la lámina basal del tejido comenzando desde la cola hasta el encéfalo posterior, dejando la médula espinal intacta. Finalmente, use tijeras finas para cortar la médula espinal en sección transversal en el encéfalo posterior y separe la médula espinal del cuerpo.
Ahora que se ha aislado la médula espinal, extiéndala en una nueva placa de Petri recubierta de silicona que contenga PBS, utilizando alfileres para sujetarla desde el encéfalo posterior hasta la cola, obteniendo así una preparación en montaje plano. Fije la médula espinal en paraformaldehído al 4 % en PBS durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, realice la tinción inmunohistoquímica siguiendo el procedimiento de inmunotinción y el protocolo escrito adjunto para montar la médula espinal abierta. Prepare el tejido para su visualización por microscopía.
Extienda grasa o silicona en forma de rectángulo sobre un portaobjetos y coloque gotas de PBS dentro del rectángulo. Utilice pinzas para colocar la médula espinal, estirándola en el centro del rectángulo, y retire el líquido que la rodea. Con un palillo de dientes, coloque una o dos gotas de medio de montaje sobre la médula espinal y cúbrala con un cubreobjetos.
Aplique presión sobre la cubierta. Para evitar burbujas de aire. Mantenga los portaobjetos en la oscuridad a cuatro grados Celsius.
Inspeccione la médula espinal utilizando microscopía confocal. A continuación se muestran algunos resultados representativos de rechazos axonales de interneuronas espinales de pollo en experimentos de control donde se expresa RFP en todas las neuronas mediante un elemento potenciador ubicuo del CMV; en estos, la mayoría de las neuronas y sus axones están marcados. Es imposible descifrar la trayectoria axonal de subpoblaciones neuronales.
Sin embargo, al aplicar elementos potenciadores específicos, se revela una vía axonal definida de una subpoblación específica de neuronas DI dos en este ejemplo. Así que acaban de ver cómo electrooperar un tubo neural de mejilla con un potenciador neuronal específico en E tres y cómo preparar una médula espinal en forma de libro abierto en E seis. Cuando realice este procedimiento, debe recordar ser cuidadoso y paciente.
Entonces esto es todo. Gracias por ver y mucha suerte con sus experimentos. Buena suerte.
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Descripción general
Este video demuestra un procedimiento para visualizar las vías axónicas de neuronas genéticamente definidas en la médula espinal de embriones de pollo mediante electrotransferencia in ovo. El método permite a los investigadores estudiar eficazmente las trayectorias axónicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Electrofisiología
Antecedentes
- Comprender las vías axónicas es fundamental para la investigación en neurociencia.
- La electroforesis in ovo es una técnica utilizada para introducir genes reporteros.
- La médula espinal embrionaria del pollo sirve como modelo para estudiar el desarrollo neuronal.
- Las poblaciones neuronales definidas genéticamente pueden proporcionar información sobre circuitos neuronales específicos.
Objetivo del estudio
- Visualizar las vías axónicas en la médula espinal embrionaria.
- Utilizar la electroforesis in ovo para estudios de expresión génica.
- Mejorar la comprensión del desarrollo neuronal y la conectividad.
Métodos Utilizados
- Transferir huevos de gallina fertilizados a una incubadora humedecida.
- Mantener la incubación a entre 37 y 38 grados Celsius.
- Realizar electroforesis in ovo para introducir genes reporteros.
- Preparar preparaciones de libro abierto de la médula espinal para su visualización.
Resultados principales
- Visualización exitosa de las vías axónicas en la médula espinal.
- Demuestra la eficacia de la electroforesis in ovo.
- Información sobre las trayectorias de poblaciones neuronales definidas genéticamente.
- Establecimiento de un método confiable para estudiar el desarrollo neuronal.
Conclusiones
- El método proporciona una herramienta valiosa para la investigación en neurociencia.
- La electroforesis in ovo es eficaz para la entrega de genes en modelos embrionarios.
- Comprender las vías axónicas puede orientar estudios sobre la formación de circuitos neuronales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite una visualización precisa de las trayectorias axónicas en poblaciones neuronales definidas genéticamente, abordando un desafío clave en la validación de objetivos donde la etiqueta bilateral dificulta distinguir entre proyecciones ipsilaterales y contralaterales. Al restringir la expresión del reportero a un solo lado del tubo neural mediante electroforesis unilateral in ovo, los investigadores logran reducir mecanismos de riesgo en hipótesis sobre circuitos neuronales desde las primeras etapas del descubrimiento. El enfoque favorece una confianza predictiva en la selección de objetivos al aclarar patrones de conectividad específicos de la vía, relevantes para modelos de enfermedades neurodesarrolladoras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de proyecciones axónicas de subpoblaciones neuronales específicas definidas por reporteros controlados por potenciadores génicos.
- Valor operativo: Proporciona una marcación unilateral para distinguir axones que proyectan ipsi y contralateralmente, reduciendo la ambigüedad en el mapeo de circuitos.
- Valor predictivo: Facilita la reducción del riesgo biológico de dianas al aclarar si una población neuronal participa en vías excitadoras o inhibitorias críticas para el mecanismo de la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera datos cuantificables sobre la trayectoria axonal como lectura fenotípica para la selección de moduladores genéticos o farmacológicos de la guía neuronal.
- Valor operativo: Produce preparaciones estandarizadas y reproducibles en montaje completo, compatibles con imágenes confocales de alta resolución y tuberías de análisis automatizadas.
- Valor de escalabilidad: Utiliza el modelo de embrión de pollo, adecuado para escalar pruebas con múltiples condiciones de actividad de potenciadores o eficiencia de electrotransferencia.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Valor Translacional: Mapea vías axonales relevantes para enfermedades en modelos de médula espinal de vertebrados, permitiendo la correlación con biomarcadores humanos de trastornos neurodesarrolladores.
- Continuidad Mecanicista: Conecta la validación inicial de dianas con la evaluación preclínica de los efectos de fármacos a nivel de circuito sobre el crecimiento o la guía axonal.
- Avance con Ajuste de Riesgo: Orienta decisiones de avance o interrupción al revelar si una diana modula patrones de proyección específicos asociados a recuperación funcional o a patología.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento, desde la generación de hipótesis sobre el blanco hasta la identificación de compuestos prometedores, proporcionando conocimientos mecanicistas que preceden al desarrollo de ensayos funcionales y apoyan la alineación de biomarcadores traslacionales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la expresión génica específica de potenciadores para definir subpoblaciones neuronales y sus trayectorias axonales.
- Selección: Permite sistemas biológicos listos para ensayos con expresión estandarizada y unilateral de reporteros para evaluar los efectos de compuestos sobre la guía axonal.
- Análisis: Proporciona lecturas espaciales cuantitativas de los patrones de proyección axonal, facilitando la comparación entre condiciones genéticas o de tratamiento.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos mediante el establecimiento de modelos de vías axonales relevantes para enfermedades, para la correlación con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la prueba iterativa de construcciones genéticas, elementos potenciadores o parámetros de electrotransferencia en múltiples objetivos neuronales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas al resolver la direccionalidad de las proyecciones axónicas, un factor crítico para evaluar los efectos de fármacos específicos en circuitos neuronales.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante parámetros definidos de electroporación (voltaje, duración del pulso, número) y manejo escalonado de embriones.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en dianas cuyas vías axónicas no coinciden con los mecanismos terapéuticos deseados.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al identificar dianas que modulan patrones específicos de proyección relacionados con resultados clínicos en indicaciones del desarrollo neurológico.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas embriológicas, incluyendo la determinación de etapas embrionarias, microinyección y optimización de parámetros de electro poración.
- Depende de instrumentación como generadores de pulsos, micromanipuladores, electrodos de tungsteno y microscopía confocal para la obtención de imágenes.
- Necesita la estandarización de la concentración de ADN, selección de elementos potenciadores y colocación de electrodos entre diferentes usuarios y laboratorios para obtener resultados reproducibles.
- Implica consideraciones de adaptación al transferir el modelo a otros sistemas vertebrados o tipos neuronales distintos a las interneuronas espinales.
- Las limitaciones prácticas incluyen la viabilidad embrionaria sensible a las condiciones de incubación y la dificultad técnica de lograr una electro poración unilateral uniforme sin dañar el tubo neural.
