La evaluación de dos dimensiones ensayos de cristalización de proteínas de membrana pequeña de Estudios de Biología Estructural de Cristalografía de electrones

El objetivo general de este procedimiento es identificar las condiciones de cristalización en 2D más óptimas para la determinación estructural de proteínas de membrana mediante cristalografía electrónica. Esto se logra primero utilizando un detergente compatible durante la purificación para solubilizar la proteína a partir de la bicapa lipídica nativa. El segundo paso del procedimiento consiste en añadir lípido exógeno y eliminar el detergente mediante diálisis de la mezcla de proteína, lípido y detergente, obteniendo así cristales en 2D bajo condiciones cuidadosamente controladas.

El tercer paso del procedimiento consiste en vitrificar mediante congelación rápida las muestras hasta un estado vítreo. El paso final del procedimiento es recopilar datos mediante microscopía crioelectrónica. En última instancia, se pueden obtener resultados que proporcionen la estructura final de la proteína mediante el procesamiento computacional de las imágenes de los datos.

Hola, soy del laboratorio. Estudio en la Escuela de Biología del Instituto de Tecnología de Georgia. Hola, soy Tina Dretted.

Soy del Laboratorio Berry de la Escuela de Química y Bioquímica y del Laboratorio Schmidt Kray de la Escuela de Biología en el Instituto de Tecnología de Georgia. Y yo soy Matt Johnson del laboratorio de Ingleborg Schmidt Cry en la Escuela de Biología del Instituto de Tecnología de Georgia. Hoy les mostraremos un procedimiento para evaluar ensayos de corales en 2D mediante EM.

Utilizamos este protocolo en nuestro laboratorio para identificar y optimizar las condiciones de cristalización en dos dimensiones. Comencemos. Para iniciar este procedimiento, se preparan muestras teñidas negativamente sobre rejillas de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de cobre con malla 400 recubiertas con carbono. Pipetee dos microlitros de la muestra de proteoliposomas bajo una rejilla TEM recubierta con carbono e incube durante 60 segundos.

Si la muestra no se distribuye uniformemente, pásela suavemente con el lateral de la punta de la pipeta. A continuación, bloquee desde el borde con un trozo arrancado de papel de filtro Watman número cuatro. Esto asegura una eliminación óptima del líquido sin una eliminación excesiva de los liposomas de protea, y ayuda a preservar la delicada película de carbono.

Inmediatamente después del secado. Aplique dos microlitros de la tinción al 1% de acetato de uranilo tras 30 segundos y seque desde el borde de la rejilla. Nuevamente, si la muestra contiene altas concentraciones de glicerol o sacarosa viscosos, típicamente en el rango de 10 a 20%, varios ciclos de lavado de la rejilla con un tampón libre de glicerol o sacarosa antes de la tinción negativa pueden ser útiles para permitir una tinción adecuada con la solución de acetato de uranilo.

Una vez que las rejillas han sido preparadas, se utiliza microscopía electrónica para visualizar la muestra a bajo aumento y evaluar la distribución de la membrana, su morfología y la calidad general de la rejilla. Luego, se emplea un alto aumento para obtener imágenes y realizar transformaciones de RIA sobre las imágenes, con el fin de identificar cristales bidimensionales. Para comenzar, coloque la rejilla en el portamuestras del microscopio electrónico y, para obtener una primera impresión de la distribución promedio de la membrana, utilice un aumento intermedio de 2000 a 10.000 ×.

Observe la extensión de la distribución de las membranas, su morfología y tamaño en un cuaderno de laboratorio. Registre vistas representativas con una cámara CCD. A continuación, si es necesario, observe las muestras con baja ampliación en el rango aproximado de 400 a 800 x para obtener una visión general de las rejillas.

Esto puede proporcionar información valiosa para evaluar la preparación de la rejilla, revelando problemas con la concentración de la muestra, distribución desigual de proteas, liposomas y rotura parcial de la película de carbono. Identifique un área de interés en la rejilla a baja o media magnificación. Luego, utilice alta magnificación para evaluar el posible orden en diferentes membranas.

Esto es crítico en las etapas iniciales de los ensayos de cristalización en 2D. Con el fin de identificar liposomas de proteína prometedores con áreas bien ordenadas y verificar la reproducibilidad durante experimentos posteriores para determinar el ajuste óptimo de alto aumento para el cribado de cristales en 2D, comience con un aumento entre 50.000 y 60.000 ×. Dependiendo de las dimensiones del cristal en 2D y del tamaño de la celda unitaria, el ajuste de alto aumento puede reducirse hasta 30.000 o aumentarse hasta 80.000.

Aquí, en una ubicación adyacente al área de interés de la imagen, desenfocamos aproximadamente menos 400 nanómetros o más, si existe incertidumbre sobre si el área de interés es realmente una membrana. Inspeccione la muestra en busca de fragmentos de película de carbono, mica u otros artefactos que podrían confundirse con proteoliposomas. Observe también los bordes para distinguir el plegado y la morfología típicos de la membrana.

A continuación, inspeccione el área de interés con una cámara CCD. Al obtener una imagen CCD con el ajuste óptimo de alto aumento, la red de una proteína de membrana más pequeña y/o principalmente hidrofóbica puede no ser observable mediante la evaluación visual de la imagen CCD misma. En este caso, se utiliza toda la imagen para una transformada de Fourier en línea o ft.

Sin embargo, si el arreglo ordenado es pequeño, esta TF contendrá una cantidad significativa de ruido; para mejorar la relación señal-ruido, reduzca el tamaño de la imagen recortada, mueva el recuadro reducido sobre la imagen y realice una TF en tiempo real. Ajuste la función gamma de la TF en tiempo real para una identificación óptima de los arreglos ordenados. Un valor de gamma excesivamente alto puede ocultar los puntos debido a las contribuciones del ruido, mientras que un valor excesivamente bajo impedirá la identificación de puntos más débiles. Espere que la resolución de los cristales 2D teñidos negativamente sea aproximadamente de 15 angstroms a una DFO de menos 400 nanómetros.

Se espera identificar de uno a tres órdenes de manchas. Observe la nitidez de las manchas y cualquier mosaico. Los cristales bidimensionales de una pequeña proteína de membrana de 18 kilodalton tienen un tamaño de hasta varias micras.

Los puntos en la TDF son nítidos y el movimiento fácilmente identificable del cuadro FT en vivo indica que la red es continua y carece de mosaico. La red de una proteína más grande con un dominio soluble más extenso puede identificarse en la pequeña pantalla de la colección de imágenes de T-E-M-C-C-D, y las TDF son necesarias para obtener una mejor evaluación de la calidad de la red, incluyendo características como el ruido de mosaico en la TDF de una proteína desordenada. Los liposomas podrían confundirse con puntos débiles; es fundamental determinar si los puntos se deben a cristales 2D pequeños de proteína o al ruido.

Mueva la caja para la ft en vivo. Si los puntos desaparecen inmediatamente, se trata de ruido, pero si permanecen sin cambios incluso en un área pequeña, es probable que estén presentes cristales, ya que los cristales lipídicos presentan una morfología distintiva y ft. Estos cristales lipídicos también pueden reconocerse mediante inspección visual de una imagen y tamaños consistentes de celda unidad.

Puede ocurrir precipitación en los ensayos iniciales. Se utiliza la inspección a alta magnificación para distinguir entre precipitación de proteínas y agregados lipídicos. En el caso de los agregados lipídicos, es posible que ya se haya producido la reconstrucción, y los siguientes experimentos solo requerirán el ajuste de parámetros necesarios para aumentar el tamaño de la membrana y generar orden, en lugar de inducir la reconstrucción a 30,000 a 50,000 ×.

Los bordes de estas estructuras oscuras revelan que están compuestas por membranas sin proteína. Las muestras de precipitación en condiciones óptimas contendrán un alto porcentaje de cristales bidimensionales. No es necesario buscar una apariencia homogénea de las membranas, ya que los cristales bidimensionales más grandes y mejor ordenados se seleccionan visualmente para la recopilación de datos.

Estos tipos de muestras serán fácilmente reconocidos cuando la cristalización de dichas muestras se utilice para la recopilación de datos de microscopía crioelectrónica, con el fin de obtener el número máximo de imágenes de alta resolución. Simplemente le mostraremos cómo tamizar cristales 2D de pequeñas proteínas de memoria mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) al realizar este procedimiento. Es importante recordar ser minucioso para no pasar por alto una condición de cristalización prometedora, ya que hasta este punto ya ha invertido una cantidad significativa de tiempo y esfuerzo.

Así es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.