De alto rendimiento de cristalización de proteínas de membrana Utilizando el Método lipídico Bicelle
9 de enero de 2012
Bicelles son mezclas de lípidos / anfifilo que mantienen las proteínas de membrana (MP) dentro de una bicapa lipídica, pero tienen un comportamiento de fase única que facilita la selección de alto rendimiento de los robots de cristalización. Esta técnica se ha producido con éxito una serie de alta resolución de estructuras de ambas fuentes procariotas y eucariotas. Este vídeo describe los protocolos para la generación de la mezcla lipídica bicelle, la incorporación de los diputados en la mezcla de bicelle, el establecimi
Este video demostrará un método para realizar ensayos de cristalización de alto rendimiento de proteínas de membrana purificadas utilizando células B lipídicas. Primero, se preparan las células B mezclando un lípido y un detergente; luego, se incorpora la proteína de membrana purificada en la mezcla de células B y se llevan a cabo ensayos de cristalización utilizando un robot de nanolitros para la inspección visual. Mediante un microscopio óptico estándar se revela la presencia de cristales.
Una vez formados, los cristales de proteína pueden extraerse y congelarse para la recopilación de datos y la determinación de la estructura. La principal ventaja de esta técnica es que, debido al comportamiento de fase único de las células B, se puede utilizar el equipo estándar y la robótica disponibles en el laboratorio para la cristalización. Preparar células B es una técnica tan sencilla que permite extraer su proteína de membrana diana del medio detergente de mi célula y colocarla en un medio lipídico.
Esto le proporciona un conjunto completamente nuevo de condiciones para tamizar. Es un método tan sencillo que se ha utilizado con éxito en muchas proteínas de membrana, que simplemente no hay razón para no intentarlo. El primer paso en la cristalización basada en células B es la preparación de una mezcla de lípidos anfifílicos formadores de células B.
Este proceso requiere un esfuerzo considerable y es el más lento. Tenga en cuenta que puede tardar varias horas en completarse. Las células B pueden formarse en una variedad de combinaciones de anfifilos lipídicos y en un amplio rango de concentraciones.
Para puntos de partida sugeridos, consulte la tabla uno en el protocolo escrito adjunto. Comience preparando un mililitro de mezcla de DMPC al 35% y capso en una proporción molar de 2,8 a uno. Para ello, pese 0,26 gramos de DMPC y 0,09 gramos de Chapo en un tubo. Ajuste el volumen hasta 1,0 mililitro utilizando agua desionizada y vortexee la mezcla.
A continuación, caliente la mezcla a aproximadamente 40 grados Celsius en un baño de agua hasta que adquiera una consistencia gelatinosa. Coloque el tubo en hielo. La muestra debe volver a volverse líquida.
Luego, agite nuevamente mediante vórtex durante unos minutos y continúe ciclando entre los pasos de calentamiento, enfriamiento y agitación mediante vórtex hasta que el lípido se disuelva completamente. Tenga en cuenta que, conforme se realizan más ciclos, la mezcla puede volverse turbia al enfriarse tras finalizar. La mezcla será un gel transparente a temperatura ambiente o superior, y un líquido viscoso sobre hielo; las muestras pueden almacenarse a largo plazo a menos 20 grados Celsius.
A continuación, se incorporan las proteínas purificadas al medio de células B. Este es un proceso sencillo que debe realizarse el mismo día de la cristalización, lo cual se muestra en la siguiente sección del video. Descongele la mezcla de células B con DMPC capso a temperatura ambiente hasta que la fase cambie a un gel transparente.
Coloque la mezcla sobre hielo para licuarla y luego vortexe brevemente para restablecer una fase homogénea de células B. A partir de este momento, mantenga la mezcla de células B y la proteína purificada sobre hielo. Esto mantendrá a las células B en una fase líquida, lo que facilitará su pipeteo.
A continuación, agregue la mezcla de células B a la proteína solubilizada con detergente purificada en una proporción de uno a cuatro, volumen a volumen. Luego, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta que la solución se vuelva clara y homogénea. Si aparecen burbujas, centrifugue brevemente para eliminarlas en una centrífuga de mesa.
Incube la mezcla en hielo durante al menos 30 minutos para favorecer la incorporación completa de la proteína en las células. La mezcla de proteína con células ya está lista para los ensayos de cristalización. Los ensayos de cristalización se demostrarán utilizando un robot de cristalización mosquito.
Enfríe una placa de 96 pocillos con fondo en V colocándola sobre hielo. Pipetee la mezcla de proteína por célula en la placa para asegurar que la viscosidad de la solución sea mínima. Mantenga la mezcla de proteína por célula sobre hielo hasta el paso final.
El robot utilizado aquí tiene cinco plataformas. Coloque la microplaca que contiene el reservorio en la plataforma tres y la tapa de cristalización sobre la cual se dispensarán las gotas en la plataforma cinco. Luego, coloque la placa de proteína por celda en la plataforma cuatro más cercana a la posición de dispensación.
Esto asegura que la mezcla de proteína con células sea la última en ser recogida por el robot y que se libere inmediatamente. Mediante el software, inicie la corrida; el robot recogerá primero la solución de depósito y luego la mezcla de proteína con células, dispensándolas sobre la tapa en forma de gotas para prevenir el calentamiento y el aumento de la viscosidad durante la dispensación. No programe al mosquito para mezclar el depósito con la mezcla de proteína con células tan pronto como finalice la corrida.
Retire la placa de proteína de células de compra del instrumento y colóquela sobre hielo. Retire la tapa del instrumento y colóquela sobre la placa que contiene la solución de reserva de manera que las gotas queden invertidas. Incube la placa a 20 grados Celsius.
Téngase en cuenta que también se pueden probar otras temperaturas para la formación y optimización de cristales. Temperaturas más altas inducen la fase lamelar, lo que tiene la ventaja de preorganizar la proteína en capas. Se puede realizar un tamizaje entre cuatro grados Celsius y 20 grados Celsius.
Temperaturas por debajo de cuatro grados Celsius pueden provocar la precipitación de los lípidos tras períodos prolongados, el primer día, el tercer día y semanalmente después de eso; evalúe la aparición y crecimiento de cristales utilizando un microscopio óptico estándar. Aquí se muestran una imagen de campo brillante y una imagen UV de cristales con forma de aguja observados únicamente en la condición de agresión. No se detectó fluorescencia proveniente de los cristales, lo que indica un falso positivo en esta imagen.
Se formó un cristal de forma alargada cuando se utilizó el metilpropanodiol como agente precipitante. El cristal fluoresce débilmente, lo que indica que podría ser un cristal de proteína, pero se descubrió que no era proteico mediante difracción de rayos X. Aquí se muestra un cristal observado aproximadamente cuatro semanas después de iniciar los ensayos.
La fuerte fluorescencia bajo luz ultravioleta confirma que se trata de un cristal de proteína. Como observó en este video. Una vez que se dispone de linfocitos B, pueden mezclarse directamente con la proteína purificada y, a partir de este punto, la cristalización avanza casi exactamente como en los protocolos estándar basados en detergentes.
Otra ventaja distintiva es la capacidad de dopar linfocitos B con lípidos específicos con fines de optimización. Esta técnica ofrece una gran versatilidad y es tan sencilla de usar que debería probarse en todos los proyectos de cristalización de proteínas de membrana.
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Descripción general
Este video demuestra un método para establecer ensayos de cristalización de alto rendimiento de proteínas de membrana purificadas utilizando bicelas lipídicas. La técnica permite la incorporación de proteínas de membrana en un medio lipídico, facilitando así el proceso de cristalización.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Estructural
- Crystalización de Proteínas de Membrana
- Biofísica
Antecedentes
- Las bicapas son mezclas de lípidos/anfifilos que estabilizan las proteínas de membrana dentro de una bicapa lipídica.
- Esta técnica presenta un comportamiento de fase único, beneficioso para el cribado de alto rendimiento.
- Ha producido con éxito estructuras de alta resolución a partir de diversas fuentes.
- Se puede utilizar equipo de laboratorio estándar para los ensayos de cristalización.
Objetivo del estudio
- Demostrar la preparación de bicapas para la cristalización de proteínas de membrana.
- Mostrar cómo incorporar proteínas de membrana en la mezcla de bicapas.
- Describir el proceso de establecimiento de ensayos de cristalización.
Métodos Utilizados
- Preparación de bicapas mediante la mezcla de lípidos y detergente.
- Incorporación de proteínas de membrana purificadas a la mezcla de bicapas.
- Ensayos de cristalización realizados utilizando un robot de nanolitros.
- Inspección visual de los cristales mediante un microscopio óptico estándar.
Resultados principales
- Formación exitosa de cristales de proteínas a partir de la mezcla de bicelas.
- Los cristales pueden extraerse y congelarse para la recopilación de datos.
- La técnica permite un uso eficiente del equipo de laboratorio estándar.
- Las capacidades de alto rendimiento mejoran el proceso de cristalización.
Conclusiones
- Las bicapas proporcionan un medio viable para la cristalización de proteínas de membrana.
- El método simplifica la transición de las proteínas desde entornos con detergentes a entornos lipídicos.
- Este enfoque puede conducir a una mejor determinación estructural de las proteínas de membrana.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cristalización de proteínas de membrana sigue siendo un cuello de botella en el descubrimiento de fármacos basado en estructuras debido a la hidrofobicidad de las proteínas y su inestabilidad en micelas de detergentes. El método de bicapas lipídicas (bicelles) proporciona un entorno lipídico más similar al nativo que mejora la estabilidad de la proteína y la calidad de los cristales, permitiendo obtener datos estructurales confiables para la validación de blancos. Este enfoque apoya la reducción de riesgos mecanicistas en fases tempranas al facilitar información de alta resolución sobre los bolsillos de unión de fármacos y los estados conformacionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la determinación estructural de proteínas de membrana en un entorno lipídico que conserva mejor la conformación nativa y los sitios de unión a ligandos.
- Valor operativo: Reduce la dependencia de cribados extensos de detergentes al proporcionar una matriz lipídica estandarizada para ensayos de cristalización.
- Valor predictivo: Los cristales de alta calidad respaldan la modelización precisa de las interacciones proteína-ligando, mejorando la confianza en las hipótesis sobre el acoplamiento al blanco.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Produce cristales de calidad para difracción que permiten una resolución a nivel atómico para el diseño de fármacos guiado por estructura.
- Valor operativo: Compatible con robótica estándar de manipulación de líquidos en nanolitros, lo que permite su integración en los protocolos existentes de cristalización de alto rendimiento.
- Escalabilidad: La baja viscosidad de las mezclas de bicelas y proteínas facilita la dispensación automatizada y reduce las barreras técnicas para la automatización.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Las estructuras obtenidas mediante cristalización en bicapas informan el diseño de inhibidores selectivos con perfiles farmacocinéticos mejorados.
- Reducción de Riesgos Mecánicos: Permite la visualización de estados conformacionales relevantes para la modulación alostérica y los mecanismos de compuerta.
- Relevancia del Modelo Preclínico: Apoya la optimización basada en la estructura de compuestos iniciales dirigidos a proteínas de membrana asociadas a enfermedades procedentes de diversos organismos.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El método de bicapas se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, proporcionando datos estructurales que orientan la química medicinal y la selección de candidatos preclínicos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis mediante la visualización de la arquitectura de proteínas de membrana y los sitios de unión de ligandos en un entorno lipídico cercano al nativo.
- Cribado: Genera condiciones de cristalización compatibles con el cribado robótico, aumentando el rendimiento y la cobertura de condiciones.
- Análisis: Proporciona datos de difracción de rayos X que permiten obtener mapas de densidad electrónica para la construcción precisa de modelos y la validación de la posición del ligando.
- Investigación Traducional: Relaciona estructuras atómicas con ensayos funcionales, permitiendo la correlación entre la afinidad de unión y las perturbaciones estructurales.
- Reutilización Empresarial: Las formulaciones de bicelas pueden estandarizarse y almacenarse para su uso repetido en múltiples objetivos de proteínas de membrana, reduciendo la variabilidad de los reactivos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la tasa de éxito en la cristalización de proteínas de membrana al imitar el entorno de la bicapa lipídica.
- Valor operativo: Utiliza equipos de laboratorio estándar y robótica, eliminando la necesidad de herramientas especializadas para manipular fluidos de alta viscosidad.
- Valor estratégico: Acelera la identificación de compuestos iniciales al reducir el tiempo necesario para obtener la estructura de dianas difíciles de proteínas de membrana.
- Impacto en la cartera: Permite tomar decisiones basadas en datos sobre continuar o descartar proyectos, gracias a información estructural confiable sobre la fármacorrelación de las dianas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de lípidos y en bioquímica de proteínas de membrana para optimizar las relaciones lípido:detergente e incorporación de proteínas.
- Depende del acceso a robots de cristalización y sistemas de incubación con temperatura controlada para el montaje y monitoreo de ensayos.
- Necesita la estandarización de los protocolos de preparación de bicapas entre los equipos para garantizar la reproducibilidad de los resultados de cristalización.
- Implica la optimización de la composición lipídica (por ejemplo, relaciones DMPC:CHAPSO) y el cribado de agentes precipitantes para satisfacer las necesidades específicas de cristalización de cada proteína.
- Se encuentra limitado por la necesidad de manipulación en frío durante la preparación para mantener la fluidez de las bicapas y prevenir transiciones de fase prematuras.
