Las respuestas de los análisis de las neuronas sensoriales olfativas ratón Utilizando la grabación Electroolfactogram Aire fase

Se monta una preparación de epitelio olfatorio sobre un plato y se coloca en una corriente de aire humidificado. Bajo un microscopio estereoscópico, un electrodo de referencia se conecta eléctricamente al tejido mediante una solución tampón. Un electrodo de registro se coloca sobre la superficie del epitelio olfatorio.

El epitelio olfativo se estimula mediante ráfagas de odorantes controladas por computadora, administradas en una corriente de aire humidificado, que transporta los odorantes hasta el epitelio olfativo. Las señales de EOG se transmiten a través de un amplificador y un digitalizador hacia la computadora de registro. Hola, soy Catherine Ciar del Laboratorio de Higiene XO del Departamento de Biología de la Universidad Johns Hopkins.

Hoy les mostraremos un procedimiento para registrar el electroolfactograma en ratones. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las respuestas de las neuronas sensoriales olfativas a los olores. Así que comencemos.

El aparato de grabación consta de un electrodo de grabación, un electrodo de referencia, un tubo de suministro de aire, una plataforma para la muestra y un microscopio estereoscópico, todos fijados sobre una mesa antivibratoria dentro de una jaula de Faraday. Se utilizan micromanipuladores para colocar los electrodos en el tubo de suministro de aire. Una corriente continua de aire se burbujea a través de agua destilada para añadir humedad antes de pasar por el tubo de suministro de aire y sobre la muestra.

Se utiliza una placa de cultivo de 60 milímetros llena de sard para adaptar de seis a ocho milímetros como superficie de montaje para la muestra. Se talla un pozo y un canal en esta protección en la placa de montaje. Para proporcionar un medio para conectar eléctricamente el electrodo de referencia a la muestra mediante una solución de Ringer modificada.

Los electrodos de registro y referencia se conectan a un amplificador. Las señales del amplificador se envían a un digitalizador y luego a una computadora. Se utiliza el software XI graph para controlar el protocolo de estimulación, registrar la señal y analizar las respuestas.

Un osciloscopio está conectado después del amplificador para la monitorización en tiempo real del potencial eléctrico durante la colocación del electrodo de registro y también durante las grabaciones de EOG. La administración de los estímulos odorantes se controla mediante un pulverizador de precisión (pico spritzer), que está conectado al mismo ordenador utilizado para la adquisición de señales, justo antes de administrar un estímulo odorante.

La salida del pulverizador pico está conectada a un frasco de odorizante que contiene un odorizante líquido. El frasco luego se conecta al tubo de suministro de aire. Ahora veamos cómo preparar los electrodos para experimentos de grabación.

El electrodo de registro es un alambre de plata clorurada en una micropipeta de vidrio estirada, rellena con solución de Ringer modificada. El electrodo de referencia es un alambre de plata clorurada. Comience la preparación de ambos electrodos instalando un alambre de plata en el porta-electrodos.

Para el electrodo de registro, debe sobresalir de uno a dos centímetros de alambre desde el extremo del porta-electrodo. Se puede dejar más alambre para el electrodo de referencia. Para agregar el recubrimiento de cloruro de plata, coloque el alambre en cloruro de sodio 0,1 molar y conecte el porta-electrodo al terminal positivo de una fuente de alimentación de corriente continua de 1,5 a 9 voltios.

El terminal negativo de la fuente de alimentación debe conectarse eléctricamente a la solución de cloruro de sodio 0,1 molar. Permita que la reacción del cloruro continúe durante 10 minutos para igualar cualquier carga estática entre el electrodo de registro y el electrodo de referencia. Toque brevemente los electrodos entre sí antes de instalarlos en el aparato de registro.

A continuación, estire una capilar de vidrio utilizando un estirador de micropipetas. La abertura en la punta de la capilar debe tener un diámetro de aproximadamente cinco a 10 micrones. Utilice un lápiz de diamante para marcar y romper el extremo romo de la capilar, de modo que quede aproximadamente dos centímetros más larga que el alambre de plata.

Utilice un soplete de butano para pulir con fuego el extremo cortado y ahora derrita 0,5 %agros en solución de Ringer modificada. Utilice una pipeta de transferencia para aspirar una pequeña cantidad de la solución fundida de agro hacia la punta del electrodo mediante una jeringa que haya sido calentada y estirada para tener un extremo largo y delgado. Llene la micropipeta estirada aproximadamente hasta la mitad.

Con la solución de Ringer modificada, agite suavemente el capilar para desprender cualquier burbuja de aire. Almacene el electrodo lleno en el frasco de almacenamiento con una pequeña cantidad de solución de Ringer modificada en el fondo hasta que esté listo para su uso. Una vez que la muestra de tejido esté preparada y lista para la grabación, coloque un capilar lleno sobre el alambre del electrodo de grabación con los electrodos preparados.

Veamos un experimento de grabación para comenzar a preparar el tejido para la grabación. Retire la piel que recubre el cráneo de un ratón sacrificado y corte longitudinalmente por la línea media, montando una mitad de la cabeza con el lado medial hacia arriba en el recipiente de montaje. Retire cuidadosamente el tabique para exponer los cornetes.

Coloque el platillo con el tejido montado sobre la plataforma de registro. Alinee la plataforma de modo que la ubicación de registro en los cornetes esté centrada bajo el microscopio. Ahora encienda el tanque de aire para suministrar aire humidificado a aproximadamente 600 mililitros por minuto a la superficie del cornete.

Coloque el tubo de suministro de aire de manera que quede aproximadamente a 10 milímetros del lugar de grabación. Configure el amplificador en modo CC, ya que la amplificación en CA inducirá artefactos en la señal de EOG. Adquiera con un filtro pasa-bajos de un kilohercio y una ganancia de 100 x.

Ahora monte los electrodos de registro y de referencia en los micromanipuladores. Baje el electrodo de referencia hasta el pozo del recipiente de montaje y cúbralo con solución de Ringer modificada de manera que quede conectado eléctricamente al tejido. Baje cuidadosamente el electrodo de registro hasta la superficie de la concha dos B o tres.

El electrodo debe tocar apenas la superficie del epitelio olfativo. Cuando el electrodo entra en contacto con el epitelio, aparecerá una línea base recta en el osciloscopio. Ahora, conecte un frasco de odorante al puerto lateral del tubo de suministro de aire en la computadora.

Inicie un protocolo de estimulación. La tasa de muestreo para la adquisición de datos debe ser de dos kilohercios o superior. El software activará un pulso de olor y comenzará la grabación.

Un protocolo de estimulación típico puede ser un pulso único de 100 milisegundos de duración, pares de pulsos de 100 milisegundos separados por un intervalo de un segundo o un pulso sostenido de diez segundos. Para minimizar la adaptación, espere de uno a cinco minutos entre protocolos después de aplicar concentraciones altas de olor. Puede quedar olor residual en el tubo; lave el tubo de aire con etanol al 95 % y séquelo antes de continuar con muestras de tejido adicionales.

El software Axo graft proporciona herramientas para medir parámetros clave de la señal EOG. Dichos parámetros incluyen la amplitud de la respuesta, la latencia, el tiempo hasta el pico y las constantes de tiempo de terminación. Varios parámetros del EOG son particularmente útiles para la comparación de respuestas normalizadas entre ratones, incluyendo la amplitud de la respuesta, el tiempo de ascenso de la latencia, el tiempo hasta el pico y la constante de tiempo de terminación.

Se muestran aquí las OG de un ratón en respuesta a la estimulación con concentraciones crecientes de acetato de amilo líquido. La línea negra en la parte superior indica el momento y la duración de la estimulación con el odorante. Aquí observamos una relación dosis-respuesta promediada a partir de cinco ratones; las barras de error corresponden a intervalos de confianza del 95 %.

Una disminución en la amplitud máxima se observa a menudo a concentraciones de olor muy altas. Se muestra un ejemplo de un EOG en respuesta a una estimulación con pulsos emparejados; un solo pulso corto de odorante provoca una adaptación que dura varios segundos. Aquí se muestra un EOG en respuesta a 10 segundos de estimulación sostenida con odorante.

El EOG muestra una desensibilización durante la presentación continua del odorante. Acabamos de mostrarle cómo registrar el electroolfactograma en ratones. Al realizar este procedimiento, es importante recordar colocar el electrodo justo sobre la superficie del epitelio y no penetrar con el electrodo por debajo de la superficie.

Registre siempre desde el mismo lado de la cabeza y evite modificaciones en el montaje para minimizar la variación; mantenga el tejido húmedo, pero sin acumular gotas de líquido. Colocar el tejido bajo aire humidificado inmediatamente después de la disección lo mantendrá en el mejor estado para el registro. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.