Actividades de imagen de olores provocados en el bulbo olfatorio de ratón utilizando reflexión óptica y señales de autofluorescencia

El objetivo general de este experimento consiste en mapear las actividades evocadas por olores en la superficie del bulbo olfatorio de ratones mediante el uso de señales ópticas intrínsecas y señales de autofluorescencia de flavoproteínas, o imágenes FAS, tras haber anestesiado al ratón y expuesto el cráneo. El hueso situado por encima del bulbo olfatorio se adelgaza. Se realiza una ventana ósea con la punta de una hoja de bisturí y luego se retira; a continuación, se construye una cámara con cemento dental que rodea la superficie expuesta del bulbo olfatorio.

Se rellena con aros y se coloca un cubreobjetos encima de esta preparación. Los mapas olfativos se adquieren secuencialmente en el mismo ratón mediante señales ópticas intrínsecas y la imagenología FAS. El estudio de otras actividades evocadas en el bulbo olfativo del ratón utilizando reflectancia óptica y señales autofluorescentes puede ayudar a responder preguntas clave sobre la organización espacial de las respuestas en el bulbo olfativo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la imagenología con desoxiglucosa o la fMRI, consiste en que permite registrar actividades evocadas con una resolución espacial de una sola glomerulosa.

Generalmente, las personas nuevas en estos métodos tendrán dificultades al comienzo de su trabajo porque tanto las habilidades quirúrgicas como las instrumentales se adquieren lentamente. La demostración visual de este método es fundamental para llamar la atención sobre los pasos cruciales de los procedimientos quirúrgicos y de obtención de imágenes. Prensione la pata trasera del ratón para confirmar la anestesia y retire el pelo del cuero cabelludo utilizando una máquina de afeitar.

Elimine cualquier pelo residual de la piel con compresas de gasa estériles empapadas en agua destilada. Coloque el ratón en el marco estereotáxico de manera que el hocico quede en el mismo plano que la parte posterior de la cabeza. Para posicionar horizontalmente el bulbo olfatorio, asegure firmemente las barras auriculares y nasales con el fin de evitar movimientos.

Aplique pomada oftálmica en los ojos para prevenir el secado durante la obtención de imágenes, y luego desinfecte el área del cuero cabelludo con Betadine utilizando tijeras estériles. Haga una incisión en la parte posterior de la cabeza entre las orejas, luego corte hacia ambos lados hasta la base de la oreja y en dirección anterior-posterior hacia la frente a lo largo de los párpados. Termine de retirar el cuero cabelludo cortando la piel del hocico.

Utilizando la barra nasal como guía, coloque al animal bajo un microscopio estereoscópico y use un hisopo empapado en solución salina para desprender suavemente el periostio en la parte superior del cráneo. Use un par de pinzas para eliminar los tejidos restantes y raspe la superficie del cráneo con un escalpelo para asegurar una preparación limpia y mantener la zona del bulbo olfatorio húmeda durante todo el experimento.

Coloque un trozo de esponja de gelatina reabsorbible, empapada con agua destilada, sobre el hueso por encima del bulbo olfatorio ubicado entre los ojos. Retire la esponja de gelatina e inicie raspando suavemente el hueso con una hoja de bisturí número 10. Mantenga un ángulo constante de 45 grados entre la hoja y el hueso, y mueva la hoja desde los párpados hacia el lado sagital del área del bulbo.

Teniendo cuidado de no aplicar presión vertical sobre el hueso ni rayar el hueso por encima del seno venoso durante el proceso de adelgazamiento. Deténgase cada cinco minutos y coloque una esponja de gelatina hidratada sobre el hueso para enfriar la preparación. Pase la esponja por el cráneo para eliminar restos óseos y polvo, y limpie periódicamente la punta del escalpelo para mantenerla limpia y afilada.

Continúe hasta que sea visible la capa de hueso esponjoso o trabecular. Cuando sea visible la fina vascularización del bulbo olfatorio, deje de raspar el hueso y use la punta de un escalpelo número 11 para trazar un área rectangular que delimite el bulbo olfatorio. Manteniendo la ventana dentro de los límites de los senos venosos, continúe raspando el hueso dentro del área rectangular.

Tenga especial cuidado con la profundidad de la punta del bisturí para evitar tocar la superficie de la dura madre. Para tener una idea del grosor del hueso restante, presiónelo suavemente con la punta de un par de pinzas. Si el hueso se dobla bajo presión, pase al siguiente paso.

Agregue una gota de solución salina y use la punta del escalpelo orientada horizontalmente para levantar el colgajo óseo. Retire cuidadosamente el colgajo con pinzas para evitar desgarrar el hueso restante. Una vez expuesta la superficie del bulbo olfatorio, verifique la ausencia de sangrado o vasos sanguíneos. Anastomosis.

Limpie el área con una esponja de gelatina empapada en solución salina. Para mantener húmedo el bulbo olfativo, aplique cemento dental de poli-acrilato usando una jeringa de calibre 29 para formar un reservorio sobre el hueso alrededor de la ventana craneal. Coloque una gota de parafina de bajo punto de fusión sobre la duramadre y coloque un cubreobjetos estéril sobre la ventana craneal para la obtención de imágenes.

Coloque el marco estereotáxico bajo el microscopio estereoscópico con la ventana craneal centrada en el campo de visión enfocado para visualizar los capilares. Cambie a luz verde de 580 nanómetros y capture una imagen anatómica de control para verificar el estado de la preparación durante la adquisición de imágenes. A continuación, proceda a capturar los ensayos de estimulación utilizando ya sea imágenes de señal óptica intrínseca bajo iluminación de 630 nanómetros o imágenes de señal autofluorescente de flavoproteína bajo iluminación de 480 nanómetros. Una sesión estándar de adquisición de imágenes incluye una línea base de cinco a 10 segundos en la que solo se administra aire, seguida por la estimulación olfativa durante tres a 10 segundos, dependiendo de la concentración de olor elegida.

Y finalmente, se registra de 70 a 82 segundos de administración de aire para la recuperación de la línea base. Aquí, la vasculatura del bulbo olfatorio se imagina a través de la ventana craneal, seguida por los resultados de un ensayo de estimulación utilizando h sinal como odorante, capturados mediante imágenes iOS y FAS. Mediante imágenes iOS, la actividad inducida por el odorante se muestra como áreas oscuras de absorción; las áreas activadas por AL se indican con flechas blancas, y las áreas activas pueden observarse tanto en ensayos individuales como en promedios de múltiples ensayos.

Cambiando a la imagen FAS en el mismo ratón, la actividad evocada en la OD ahora se muestra como áreas blancas de emisión de autofluorescencia indicadas por las flechas negras, y también puede observarse tanto en ensayos individuales como en promedios de múltiples ensayos. Obsérvese que tanto las zonas negras de absorción observadas mediante imagen iOS como las áreas blancas de emisión de autofluorescencia observadas mediante imagen FAS se superponen. Esta coincidencia espacial confirma que ambas técnicas permiten la visualización de los mismos glomérulos olfatorios. Una vez establecido el orden maestro de adquisición de imágenes, las actividades evocadas mediante señales de reflectancia óptica y autofluorescencia pueden obtenerse en una hora para la cirugía y un par de horas para la adquisición de imágenes.

Las principales desventajas del uso de estos métodos de imagen óptica son el hecho de que no pueden aplicarse para visualizar mapas olfativos en ratones libres de movimiento. Y debido a la penetración limitada de los fotones en los tejidos biológicos, no permiten acceder a los glomérulos olfativos ventrales tras su desarrollo a finales de los noventa, registrando señales intrínsecas en el sistema olfativo. Quizás una vía para que los investigadores en el campo de la imagen óptica explore las características del recubrimiento especial del olfato.

En el bulbo olfatorio, la imagenología de autofluorescencia de flavoproteínas es una técnica prometedora para obtener nuevas perspectivas sobre la organización espacial de la OD utilizando señales ópticas endógenas.